ВведениеГосударственная политика в области пищевойпромышленности нацелена на поддержание здоровьяграждан путем удовлетворения потребностейнаселения в сбалансированном питании сучетом привычек и традиций, экономических ифизиологических возможностей [1, 2]. Важностьмолока и молочных продуктов в этом вопросебесспорна. Совокупность сбалансированности макро-и микрокомпонентов, высокой пищевой ценности ихорошей усвояемости делает молоко незаменимымпищевым продуктом в рационе питания.Высокотехнологичные приемы переработки молока,в том числе производство сухого молока, позволяютснабжать разнообразными молочными продуктаминаселение как труднодоступных регионов, так игородских агломераций, снимая вопрос сезонностимолочной отрасли [3]. В основе производствавысококачественных пищевых продуктов, в томчисле молочных, лежит ценность поступающего напереработку сырья.К молоку как к сырьевому ингредиенту длявыработки большого ассортимента молочныхпродуктов, таких как сыр, творог, кисломолочныепродукты, консервы и др., включая группыфункциональных и геродиетических продуктовпитания, предъявляются повышенные требования вчасти биологической безопасности и соответствияего физико-химических и технологических свойстврегламентируемым показателям [4–7].Сухое молоко – универсальный сырьевойкомпонент. Он позволяет преодолеть проблемусезонности сырого молока с возможностью егодоставки в испытывающие дефицит отдаленныерайоны, обеспечивая стабильность сырьевыхресурсов и качество восстановленных продуктовпереработки молока [3]. Однако выход и качествоготовой продукции обусловлены эффективностьюпереработки поступающего молочного сырья [8]. Всвязи с этим необходимо акцентировать вниманиена таких технологических свойствах молока кактермоустойчивость и сыропригодность.Термоустойчивость молока или способностьбелковых систем молока выдерживатьвысокотемпературную обработку без коагуляциипредопределяет возможность получениямолочных продуктов длительного хранения [9].Сыропригодность молока или способность егокоагулировать под воздействием сычужногофермента с образованием плотного казеиновогосгустка – необходимое условие для производствасычужных сыров [10].Использование генетических маркеров, ассо-циированных с качественными признакамимолочной продуктивности, оказывающими влияниена состав и технологические свойства молока,находит широкое применение в животноводстве. Вкачестве одного из таких маркеров рассматриваетсяген ϰ-казеина (CSN3), локализованный на 6-ойхромосоме генома Bos taurus [11, 12]. Из 13охарактеризованных вариантов гена ϰ-казеинакрупного рогатого скота часто встречаемыми убольшинства пород молочного направления являютсяаллели А и В CSN3, кодирующие соответствующиеструктурные элементы белков, различающиеся двумяаминокислотными заменами в 136 и 148 положенияхполипептидной цепи [13, 14].В научной литературе аллели А и В генаCSN3 признаны взаимосвязанными с молочнойпродуктивностью, а также составом и техноло-гическими свойствами молока [11, 12, 14–16]. Молокоот коров с генотипами AB и BB имеет диаметрмицелл казеина менее 200 нм, тогда как с генотипомAA – более 200 нм [13]. Это оказывает определенноевлияние на его коагуляционные свойства [17]. Приэтом не все исследователи трактуют взаимосвязьаллелей А и В с технологическими свойствамимолока однозначно. Это может быть связано сдифференциацией исследуемых выборок животныхи объемами технологических выработок в рамкахэксперимента [8].Однако большинство авторов по итогамсвоих исследований находият, что молоко откоров с превалированием аллеля В по гену CSN3характеризуется высоким содержанием жира,белка, сухих веществ и лучшей сыропригодностью[12–14, 18]. Следовательно, в рамках рациональнойпереработки целесообразно использовать молоко дляпроизводства сыров и продуктов молочнокислогоброжения. В тоже время наиболее термостойкимсчитается молоко от коров с преобладанием аллеляА по гену CSN3 с рекомендацией его применениядля выработки питьевого пастеризованного истерилизованного молока с длительным срокомхранения и молочных консервов [19].Одним из естественных компонентов молокаявляются соматические клетки, влияющие нетолько на продуктивность коров, но и на качествомолока. При этом ряд научных работ показалвозможность использования этих клеток в качествеДНК-содержащего материала, который может бытьисследован в образцах сырого и сухого молокамолекулярно-генетическими методами [20–22].Разработка и применение новых подходов и решенийпо оценке качества сборного сухого молока, втом числе на основе ДНК-технологий, являетсяактуальной задачей [7].Целью настоящей работы являлась разработкаспособа определения в сухом молоке соотношенияотносительных долей аллелей селекционно-значимого гена ϰ-казеина крупного рогатогоскота посредством молекулярно-генетическойи биоинформационной системы оценки сырьяс позиции рациональности его дальнейшейпереработки.Объекты и методы исследованияОбъекты экспериментальных исследований:образцы сборного сухого цельного и обезжиренногомолока (СЦМ и СОМ), а также сборного сырогомолока с известным соотношением относительныхдолей аллелей гена ϰ-казеина крупного рогатогоскота в качестве эталона.Разработанный способ определения в сборномсухом молоке соотношения относительных долейаллелей гена ϰ-казеина крупного рогатого скотавключает экстракцию ДНК из исследуемыхобразцов, проведение совмещенной техникиполимеразной цепной реакции и полиморфизмадлин рестрикционных фрагментов (ПЦР-ПДРФ),учет результатов амплификации и эндонуклеазногорасщепления нуклеиновых кислот методомэлектрофореза и анализ информационныхданных, в т. ч. интерпретируемых с помощьюсозданных математических алгоритмов (формул) ипрограммного обеспечения.Экстракция ДНК из исследуемых образцов сиспользованием комплекта реагентов «ДНК-сорб-С-М» (ЦНИИ Эпидемиологии, Россия). Буфер длялизирующего реагента и раствор для отмывки 1выдерживали при температуре 64 °С («Термит»,ДНК-технология, Россия) до полного растворениякристаллов.В пробирки типа Eppendorf помещали навескиисследуемых образцов (для СЦМ и СОМ – масса50 мг; для сборного сырого молока – объем 1,5 мл)и плотно закрывали крышки. Пробирки собразцами сборного сырого молока подвергалицентрифугированию с частотой вращения12 000 об/мин в течение 15 мин. Затем из каждойпробирки удаляли надосадочную жидкость,используя отдельные наконечники на 200 мкл (безфильтра) и применяя аспиратор с колбой ловушкой(«FTA-1», Biosan, Латвия).В каждую пробирку с исследуемыми образцамиСЦМ, СОМ или сборного сырого молокадобавляли буфер для лизирующего реагента илизирующий реагент в количествах 400 мкл и 17 мклсоответственно.Содержимое пробирок тщательно перемешивалии при плотно закрытых крышках осаждали каплина вортексе («FV-2400», Biosan, Латвия). Затемпробирки термостатировали при температуре 64 °С втечение 60 мин («Термит», ДНК-технология, Россия),периодически (5 раз через каждые 10–12 мин)встряхивая на вортексе.Нерастворившиеся частицы образцов седиминти-ровали в процессе центрифугирования («CM-50»,Elmi, Латвия) при 12 000 об/мин в течение 5 мин.В новые пробирки типа Eppendorf объемом1,5 мл с плотно закрывающимися крышкамиотдельным наконечником добавляли по 25 мклресуспендированного сорбента универсального,предварительно подвергнутого интенсивномувстряхиванию на вортексе.Отдельными наконечниками с фильтрами изпробирок с лизированными образцами отбиралинадосадочную жидкость объемом 200–350 мкл ипереносили в пробирки с сорбентом. Содержимоепробирок перемешивали на вортексе, затем пробиркипомещали в штатив на 10 мин, периодическивстряхивая (каждые 2 мин). Далее пробиркицентрифугировали при 5 000 об/мин в течение 60 с.Из каждой пробирки отдельным наконечником безфильтра на 200 мкл, используя аспиратор с колбойловушкой, удаляли надосадочную жидкость.528Gilmanov Kh.Kh. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 3, pp. 525–535В пробирки вносили по 300 мкл раствора дляотмывки 1 и, плотно закрыв крышки, встряхивалина вортексе до полного ресуспендирования сорбентауниверсального. Затем пробирки центрифугировалипри 5 000 об/мин в течение 60 с. Далее из каждойпробирки отдельным наконечником без фильтра на200 мкл, используя аспиратор с колбой ловушкой,удаляли надосадочную жидкость.В пробирки добавляли по 500 мкл растворадля отмывки 2. Плотно закрыв крышки,пробирки встряхивали на вортексе до полногоресуспендирования сорбента универсального ицентрифугировали при 10 000 об/мин в течение 60с. Затем из каждой пробирки удаляли надосадочнуюжидкость отдельным наконечником без фильтра на200 мкл, используя аспиратор с колбой ловушкой.Процедуры внесения раствора для отмывки 2,центрифугирования и удаления надосадочнойжидкости осуществляли повторно.Пробирки с открытыми крышками помещалив термостат с температурой 64 °С на 8 ± 2 миндля подсушивания сорбента универсального,добавляли по 50 мкл буфера для элюции B,перемешивали содержимое на вортексе до полногоресуспендирования сорбента. Затем пробирки сноватермостатировали 8 ± 2 мин при температуре 64 °С,периодически (1 раз в минуту) перемешивая навортексе. Далее пробирки центрифугировалипри 12 000 об/мин в течение 60 с. Надосадочнуюжидкость использовали в качестве пробы ДНК дляпостановки ПЦР.Проведение ПЦР-ПДРФ. Реагенты для проведенияПЦР: деионизированная вода (dH2O); смесь dNTP(2,5 мМ каждого)1; Taq ДНК полимераза (5 ед/мкл)1;буфер для Taq ДНК полимеразы (10×)1; праймерыJK5 и JK3 (25 мкМ каждого); проба ДНК.Реагенты для проведения ПДРФ: деионизиро-ванная вода (dH2O); SE-буфер O для рестриктазы(10×)1; эндонуклеаза рестрикции HinfI (20 ед/мкл)1;ПЦР-проба.Исходные и рабочие концентрации реагентови поочередно вносимые их объемы для приго-товления реакционных смесей представлены всоответствующем ПЦР-ПДРФ-протоколе, изначальноиспользуемом для генотипирования крупногорогатого скота по CSN3-гену (табл. 1). В протоколеуказаны нуклеотидные последовательностипраймеров, режим термоциклирования и размергенерируемого ПЦР-продукта в части ПЦР-про-токола, а также режим инкубирования и размер1 Производство ООО «СибЭнзим», Россия.Таблица 1. ПЦР-ПДРФ-протокол для амплификациии эндонуклеазного расщепления локуса CSN3-гена крупного рогатого скотаTable 1. PCR-RFLP protocol for amplification and endonuclease cleavage of the bovine CSN3 gene locusПЦР-протоколРеагент Исходная концентрация Рабочая концентрация 1 проба, мкл 10 проб, мклdH2O 13 130dNTP 2,5 мM 0,25 мM 2 20SE буфер 10× 1× 2 20Taq ДНК полимераза 5 ед 1 ед 0,2 2JK5 25 мкМ 0,5 мкМ 0,4 4JK3 25 мкМ 0,5 мкМ 0,4 4Проба ДНК 2ВСЕГО 20Нуклеотидные последовательности праймеров:JК5: 5/-АТСАТТТАТGGCCATTCCACCAAAG-3/. JКЗ: 5/-GCCCATTTCGCCTTCTCTGTAACAGA-3/.Режим термоциклирования (амплификатор «Терцик», «ДНК-технология», Россия):×1:94 °С – 240 c;×35:94 °С – 10 с, 63 °С – 10 с, 72 °С – 10 с;×1:72 °С – 420 c.ПЦР-продукт 350 bpПДРФ-протоколРеагент Исходная концентрация Рабочая концентрация 1 проба, мкл 10 проб, мклdH2O 12,25 122,5SE-буфер O 10× 1× 2,5 25HinfI 20 ед 5 ед 0,25 2,5ПЦР-проба 10ИТОГО 25Инкубация при 37 °С в течение 12 ± 2 чПЦР-ПЦРФ-фрагментыГенотип AA = 134/131/85 bpГенотип BB = 265/85 bpГенотип AB = 265/134/131/85 bpгенерируемых ПЦР-ПДРФ-фрагментов в частиПДРФ-протокола.Детекция результатов амплификации и эндо-нуклеазного расщепления нуклеиновых кислотметодом электрофореза и анализ информационныхданных.1. Приготовление рабочего 1× TAE буфера.К 10 мл концентрированного 50× трис-ацетатногоэлектродного буфера (ЗАО «Синтол», Россия)добавляли дистиллированную воду, доводя объем до500 мл. Хорошо перемешивали. Далее в электродный1× TAE буфер вносили 15 мкл 1 % раствора этидиумабромида.2. Приготовление 2 % агарозного геля. Навескуагарозы массой 2 г (Biotechology Grade, Amresco,США) переносили в стеклянную колбу изтермостойкого стекла объемом 250 мл и добавляли100 мл готового рабочего раствора электрофорезногобуфера. Содержимое колбы перемешиваливращательными движениями и помещали в микро-волновую печь, выдерживая при мощности 800 Втв течение 90 с до полного растворения агарозы.Затем колбу с расплавленной агарозой вынималии аккуратно перемешивали содержимое плавнымивращательными движениями. Далее колбу с агарозойвторично помещали в микроволновую печь на 90 с,доводя агарозу до кипения. Колбу вынимали измикроволновой печи и остужали содержимое дотемпературы 65–70 °С, аккуратно перемешиваясодержимое вращением колбы.3. Расплавленную агарозу заливали в формукамеры. Толщина агарозного геля должна быть около6 мм.4. После полного застывания геля аккуратновынимали из него гребенку. Подложку с готовымгелем помещали в камеру для горизонтальногоэлектрофореза («SE-2», Хеликон, Россия), куда затемзаливали готовый электродный буфер выше уровнягеля на 5 мм.5. Пробирки с продуктами амплификациипомещали в штатив. В чистые пробирки отбиралипо 10 мкл ПЦР-пробы. В них добавляли 2 мклбуфера для нанесения (10× SE-буфер для нанесенияс красителем, ООО «СибЭнзим», Россия). Затемокрашенные амплификаты вносили в лунки геля,используя новый наконечник для каждой пробы.6. Камеру подключали к источнику питания ивключали его («Эльф-4», ДНК-Технология, Россия).Запрограммированные параметры: выходное напря-жение – 150 В, выходной ток – 150 мА, выходнаямощность – 50 Вт. Время электрофореза – 30 мин.7. Камеру отключали от источника питаниясразу после окончания электрофореза. Гельпереносили на трансиллюминатор системы гель-документирования «Gel Doc XR+» с поддержкойпрограммного обеспечения («Image Lab» Bio-Rad,США). Изображение геля получали на компьютерес помощью видеосистемы c последующим егоанализом и документированием.8. Программно рассчитывали значение абсо-лютного количества (Quantity) детектируемогоПЦР-продукта длиной 350 bp (band) каждойанализируемой ПЦР-пробы в двойной повторности.Для этого задавали значение контрольной(эталонной) ПЦР-пробе2 первой повторности, равное100, выбрав единицу измерения – none, выставивлинейную регрессию – Linear. Полученные в ходеанализа данные были необходимы для расчетаотбираемого объема ПДРФ-пробы для внесения влунки агарозного геля по формуле:U = 100 × 20 / Q (1)где U – отбираемый объем ПДРФ-пробы длявнесения в лунки агарозного геля за исключениемконтрольной ПДРФ-пробы первой повторности, мкл;100 – значение абсолютного количества (Quantity)контрольной ПЦР-пробы первой повторности;20 – отбираемый объем контрольной ПДРФ-пробыпервой повторности для внесения в лункиагарозного геля, мкл; Q – значение абсолютногоколичества (Quantity) детектируемого ПЦР-продуктаанализируемой контрольной ПЦР-пробы второйповторности, а также последующих ПЦР-проб вдвойных повторностях, рассчитанных программно.9. Пробирки с продуктами эндонуклеазногорасщепления помещали в штатив, отбирали из нихрассчитанный, согласно п. 8, объем ПДРФ-пробыи вносили в чистые пробирки с последующимсмешиванием с 2 мкл буфера для нанесения. Затемокрашенные ПДРФ-пробы вносили в лунки геля,используя новый наконечник для каждой пробы.10. Камеру подключали к источнику питания ивключали его. Запрограммированные параметры:выходное напряжение – 150 В, выходной ток– 150 мА, выходная мощность – 50 Вт. Времяэлектрофореза – 40 мин.11. После завершения времени электрофорезавыключали источник питания, переносили гель натрансиллюминатор системы гель-документирования«Gel Doc XR+» с поддержкой программногообеспечения («Image Lab», Bio-Rad, США). Получалиизображение геля на компьютере с помощьювидеосистемы c последующим его анализом идокументированием.12. Программно рассчитывали для каждойанализируемой ПДРФ-пробы в двойной повторностизначение абсолютного количества (Quantity) детекти-руемых ПДРФ-фрагментов с длинами 134/131 bp(band 2), занимающих среднее положение междуверхним ПДРФ-фрагментом размером 265 bp (band 1)и нижним ПДРФ-фрагментом размером 85 bp (band 3).Для этого задавали значение Quantity, равное 100для band 1 (265 bp) каждой пробы, выбрав единицуизмерения – none, выставив линейную регрессию– Linear. Полученные в ходе анализа данные былинеобходимы для определения в сборном сухоммолоке соотношения относительных долей аллелейгена CSN3.13. На следующем этапе последовательнорассчитывали числовой показатель контрольнойРисунок 1. Электрофореграмма результата ПЦР-анализаисследуемых образцов с праймерами JK5+JK3и программный расчет значения абсолютного количества(Q) детектируемого ПЦР-продукта длиной 350 bp каждойанализируемой ПЦР-пробы в двойной повторности(скриншот обработанных данных в «Image Lab»).1 – ПЦР-проба образца СОМ1 первой повторности (152,0);2 – ПЦР-проба образца СОМ1 второй повторности (157,4);3 – ПЦР-проба образца СОМ2 первой повторности (155,0);4 – ПЦР-проба образца СОМ2 второй повторности (150,9);5 – ПЦР-проба образца СЦМ первой повторности (143,8);6 – ПЦР-проба образца СЦМ второй повторности (141,3);7 – ПЦР-проба контрольного образца (генотип CSN3АВ)первой повторности (100,0); 8 – ПЦР-проба контрольногообразца (генотип CSN3АВ) второй повторности (115,4)Figure 1. Electropherogram of the result of PCR analysis of testsamples with primers JK5 + JK3 and software calculation of theabsolute amount (Q) of the detected PCR product of 350 bp in lengthfor each analyzed PCR sample in duplicate (a screenshot of theprocessed data in the Image Lab). 1 – PCR test of the COM1 sample ofthe first replication (152.0); 2 – PCR sample of the COM1 sample ofthe second replication (157.4); 3 – PCR sample of the COM2 sampleof the first replication (155.0); 4 – PCR sample of the COM2 sampleof the second replication (150.9); 5 – PCR sample of the SCM sampleof the first replicate (143.8); 6 – PCR sample of the SCM sample of thesecond replicate (141.3); 7 – PCR test of the control sample (genotypeCSN3AB) of the first replication (100.0); 8 – PCR sample of the controlsample (genotype CSN3AB) of the second replication (115.4)Таблица 2. Отбираемые объемы ПДРФ-проб для внесения в лунки агарозного геляTable 2. Selected volumes of RFLP samples to be put into agarose gel wells№ ПЦР-проба образца сборного сухого молока Quantity Отбираемый объем ПДРФ-пробы, мкл1 ПЦР-проба образца СОМ1 первой повторности 152,0 13,12 ПЦР-проба образца СОМ1 второй повторности 157,4 12,73 ПЦР-проба образца СОМ2 первой повторности 155,0 12,94 ПЦР-проба образца СОМ2 второй повторности 150,9 13,25 ПЦР-проба образца СЦМ первой повторности 143,8 13,96 ПЦР-проба образца СЦМ второй повторности 141,3 14,17 Контрольная ПЦР-проба первой повторности (генотип CSN3АВ) 100,0 20,08 Контрольная ПЦР-проба второй повторности (генотип CSN3АВ) 115,4 17,3Рисунок 2. Электрофореграмма результата ПЦР-ПДРФ-анализа по аллельным вариантам A и B гена CSN3 спраймерами JK5+JK3 и эндонуклеазным расщеплениемрестриктазой HinfI, включая программный расчет значенийабсолютного количества (Q1/Q2) детектируемых ПЦР-ПДРФ-фрагментов (скриншот обработанных данных в«Image Lab»). 1 – HinfI-ПДРФ-профиль образца СОМ1первой повторности (100/233,4); 2 – HinfI-ПДРФ-профильобразца СОМ1 второй повторности (100/262,4); 3 – HinfI-ПДРФ-профиль образца СОМ2 первой повторности(100/281,1); 4 – HinfI-ПДРФ-профиль образца СОМ2второй повторности (100/282,3); 5 – HinfI-ПДРФ-профильобразца СЦМ первой повторности (100/230,4); 6 – HinfI-ПДРФ-профиль образца СЦМ второй повторности(100/197,5); 7 – HinfI-ПДРФ-профиль контрольного образца(генотип CSN3АВ) первой повторности (100/54,4); 8 – HinfI-ПДРФ-профиль контрольного образца (генотип CSN3 АВ)второй повторности (100/49,5)Figure 2. Electropherogram of the result of PCR-RFLP analysis forallelic variants A and B of the CSN3 gene with primers JK5 + JK3 andendonuclease digestion with the restriction enzyme HinfI, includingthe software calculation of the absolute amount (Q1 / Q2) of thedetected PCR-RFLP-processed fragments (a screenshot in Image Lab).1 – HinfI-RFLP-profile of the COM1 sample of the first replication(100/233.4); 2 – HinfI-RFLP profile of the COM1 sample of the secondreplication (100/262.4); 3 – HinfI-RFLP-profile of the sample СОМ2 ofthe first replication (100/281.1); 4 – HinfI-RFLP-profile of the COM2sample of the second replication (100/282.3); 5 – HinfI-RFLP-profileof the SCM sample of the first replicate (100/230.4); 6 – HinfI-RFLPprofile of the CMM sample of the second replication (100/197.5); 7 –HinfI-RFLP-profile of the control sample (genotype CSN3AB) of the firstreplication (100/54.4); 8 – HinfI-RFLP-profile of the control sample(genotype CSN3AB) of the second replication (100/49.5)531Гильманов Х. Х. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. № 3 С. 525–535ПДРФ-пробы2 первой и второй повторности(с последующим выведением среднеарифмети-ческого значения) по формуле:ЧП = Q1 / Q2 (2)где ЧП – числовой показатель; Q1 – значениеабсолютного количества (Quantity) детектируемогоПДРФ-фрагмента размером 265 bp (band 1),равное 100; Q2 – значение абсолютного количества(Quantity) детектируемого ПДРФ-фрагмента размером134/131 bp (band 2).14. Выстраивали процентную шкалу соотношенияотносительных долей аллелей гена CSN3 (прописываядолю аллеля А CSN3 в процентном выражении,оставшаяся часть которого приходилась на долюаллеля B CSN3) с расчетом соответствующегочислового показателя, предварительно рассчитавожидаемое значение Quantity для band 1 (оQ1) и band2 (оQ2) по формулам:оQ1 = B% × нQ1 / кB % (3)где оQ1 – ожидаемое значение Quantity дляband 1; B% – доля аллеля B в процентном выражениивыстраиваемой шкалы; нQ1 – наблюдаемое значениеQuantity для band 1 контрольной ПДРФ-пробы,равное 100; кB % – доля аллеля B контрольнойПДРФ-пробы, %.оQ2 = A% × нQ2 / кA% (4)где оQ2 – ожидаемое значение Quantity дляband 2; A% – доля аллеля A в процентном выражении2 Контрольные (эталонные) ПЦР- и ПДРФ-пробы формировалисьиз числа образцов сборного сухого молока, сборного сырогомолока с известным соотношением относительных долей аллелейгена ϰ-казеина крупного рогатого скота, прошедших этапыпробоподготовки, экстракции, амплификации и эндонуклеазногорасщепления нуклеиновых кислот. В качестве контрольного(эталонного) образца также использовали препарат ДНК,выделенный из коровьего молока с генотипом AB гена CSN3 сотносительной долей аллеля А, равной 50 %.выстраиваемой шкалы; нQ2 – наблюдаемоесреднеарифметическое значение Quantity для band2 контрольной ПДРФ-пробы; кA% – доля аллеля Aконтрольной ПДРФ-пробы, %.15. Оперируя полученными значениями,рассчитывали числовой показатель для выстроеннойпроцентной шкалы соотношения относительныхдолей аллелей гена CSN3 по формуле:шЧП = оQ1 / оQ2 (5)где шЧП – числовой показатель для выстроеннойпроцентной шкалы соотношения относительныхдолей аллелей гена CSN3; оQ1 – ожидаемое значениеQuantity для band 1; оQ2 – ожидаемое значениеQuantity для band 2.16. Рассчитывали для каждой анализируемойПДРФ-пробы в двойной повторности ЧП согласноформуле, отраженной в п. 13 с последующим выве-дением среднеарифметического значения.17. Полученные ЧП сопоставляли с соответ-ствующими шЧП для выстроенной процентнойшкалы соотношения относительных долей аллелейгена CSN3, прописывая установленную долю аллеляА в процентном выражении с указанием абсолютнойи относительной погрешности (± %).Разработанная программа «Расчет соотношенияотносительных долей аллелей ϰ-казеина в молокесборном» размещена в открытом доступе по адресуhttps://www.wolframcloud.com/obj/e90009f8-53de-4c24-8980-837061c0ee22.Результаты и их обсуждениеРезультаты генетического тестирования образцовСОМ и СЦМ на предмет определения в сборномсухом молоке соотношения относительных долейаллелей гена ϰ-казеина с использованным наборомпраймеров (JK5 и JK3) эндонуклеазы рестрикцииHinfI для проведения ПЦР-ПДРФ-анализа показалиудовлетворительную воспроизводимость и интерпре-тацию полученных данных.Таблица 3. Установленные значения абсолютных количеств Quantity (Q1 и Q2) детектируемых ПДРФ-фрагментовс длинами 265 bp (band 1) и 134/131 bp (band 2) проанализированных ПДРФ-проб с выведенным среднеарифметическим ЧПTable 3. Established values of the absolute amounts of Quantity (Q1 and Q2) of the detected RFLP fragments with lengths of 265 bp (band 1)and 134/131 bp (band 2) of the analyzed RFLP samples with the derived arithmetic mean index№п.пПДРФ-проба образца сборного сухого молока Quantityband 1 (Q1)Quantityband 2 (Q2)ЧП1 HinfI-ПДРФ-профиль образца СОМ1 первой повторности 100 233,4 0,4032 HinfI-ПДРФ-профиль образца СОМ1 второй повторности 100 262,43 HinfI-ПДРФ-профиль образца СОМ2 первой повторности 100 281,1 0,3554 HinfI-ПДРФ-профиль образца СОМ2 второй повторности 100 282,35 HinfI-ПДРФ-профиль образца СЦМ первой повторности 100 230,4 0,4676 HinfI-ПДРФ-профиль образца СЦМ второй повторности 100 197,57 HinfI-ПДРФ-профиль контрольного образца (генотип CSN3АВ) первой повторности 100 54,4 1,9258 HinfI-ПДРФ-профиль контрольного образца (генотип CSN3АВ) второй повторности 100 49,5532Gilmanov Kh.Kh. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 3, pp. 525–535Праймеры JK5 и JK3 инициировали ампли-фикацию локуса гена CSN3 крупного рогатого скотадлиной 350 bp (рис. 1).В таблице 2 представлены рассчитанные поформуле (1) отбираемые объемы ПДРФ-пробисследуемых образцов для внесения в лункиагарозного геля.HinfI-ПДРФ-анализ генерируемых генотип-специфичных фрагментов (AA = 134/131/85 bp,BB = 265/85 bp и AB = 265/134/131/85) обеспечивалкорректную процедуру генетического тестированияисследуемых образцов (рис. 2).В таблице 3 представлены программносгенерированные для каждой анализируемой ПДРФ-пробы в двойной повторности значения абсолютногоколичества Q2 детектируемых ПДРФ-фрагментовс длинами 134/131 bp (band 2) при установленномзначении Q1 для band 1 (265 bp), равном 100, споследующим расчетом среднеарифметическогочислового показателя (ЧП) согласно формуле (2).На рисунке 3 показан принцип работыпрограммы «Расчет соотношения относительныхдолей аллелей ϰ-казеина в молоке сборном» свнесением соответствующих данных: доля аллеля Aконтрольной ПДРФ-пробы, выраженная в процентах(кА, %); наблюдаемое (среднеарифметическое)значение Quantity для band 2 контрольной ПДРФ-пробы (нQ контроля); информация об исследуемомобразце (наименование образца); наблюдаемое(среднеарифметическое) значение Quantity для band 2анализируемой ПДРФ-пробы (нQ2 образца).На рисунке 4 показан выданный программойрезультат расчета соотношения относительных долейаллелей гена ϰ-казеина в исследуемых образцахсборного сухого молока, выраженный в процентахдоли аллеля А с дополнительным указаниемабсолютной и относительной погрешностей.Также ниже приведен информационный блоксгенерированных числовых показателей длявыстроенной процентной шкалы.ВыводыПроизводство молока, полученного откоров желаемого генотипа по гену CSN3, –многоступенчатый процесс. Он связан с решениемряда задач, включающих в себя комплексзоотехнических, ветеринарных, технологическихи экономических аспектов работы. ЭлементыДНК-технологии прижизненного формированиямолочной продуктивности животных, составаи технологических свойств молока, успешновнедренные в селекционно-племенную деятельность,также могут быть интегрированы в молекулярно-генетическую и биоинформационную систему оценкисырья и продуктов его переработки.Представленная в настоящей работе методологияразработанного способа определения в сборномсухом молоке соотношения относительных долейаллелей гена ϰ-казеина крупного рогатого скотареализована комплексом лабораторных процедур,включающих выделение нуклеиновых кислот,Рисунок 3. Интерфейс разработанной программы«Расчет соотношения относительных долей аллелейϰ-казеина в молоке сборном» на начальном этапе внесениясоответствующих данныхFigure 3. Interface of the developed program “Calculationof the ratio of the relative proportions of alleles of ϰ-caseinin bulk milk” at the input stageРисунок 4. Интерфейс разработанной программы«Расчет соотношения относительных долей аллелейϰ-казеина в молоке сборном» на заключительномэтапе выдачи результата расчетаFigure 4. Interface of the developed program “Calculation of the ratioof the relative proportions of alleles of ϰ-casein in bulk milk”at the final stage533Гильманов Х. Х. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. № 3 С. 525–535проведение ПЦР-ПДРФ, электрофорезную детекциюи анализ полученных результатов математическимиалгоритмами и программным обеспечением. Приэтом созданная специализированная программа«Расчет соотношения относительных долей аллелейϰ-казеина в молоке сборном», размещенная воткрытом сетевом доступе, обеспечивает корректнуюи оперативную интерпретацию информационныхданных.Дальнейшее развитие данного направленияпозволит усовершенствовать алгоритмыматематического моделирования оценочныхкритериев уровня соответствия технологическихсвойств сборного коровьего молока рекомендуемымпоказателям по свертываемости и термоустойчивости,а также оптимизировать технологии производствамолочных продуктов в контексте предварительноймолекулярно-генетической и биоинформационнойсистемы оценки сырья с позиции рациональности егодальнейшей переработки.Критерии авторстваАвторы в равной степени участвовали в подго-товке и написании статьи.Конфликт интересовАвторы заявляют об отсутствии конфликтаинтересов.ContributionAll the authors bear equal responsibility for thecontent of the article.Conflicts of interestThe authors declare that there is no conflict of interestregarding the publication of this article.