ВведениеГорячий источник Абаканский Аржан находитсяв Таштыпском районе республики Хакасия(51°47’53.9»N 88°15’01.1»E). Согласно гидро-химическим и геоструктурным исследованиям водыисточника кремнистые, имеют нейтральный рН 7,2 итемпературу 37–40 °С [1, 2]. Т. А. Олигер исследовалхимический состав воды источника АбаканскийАржан (табл. 1) [3].На большое содержание кремниевых кислот всоставе оказывает влияние температура и давление.Содержание кремниевых кислот выше 100 мг/лхарактерно для высокотермальных вод с темпе-ратурой ˃ 70 °С [1].Экстремофилы – это микроорганизмы, способныежить и размножаться в экстремальных условиях среды.Существует множество классов экстремофилов,классифицированные по условиям окружающейсреды. В отношении микробного набора термальныхисточников можно выделить наиболее изученныерода, среди которых экстремофильные прокариоты-деструкторы водорода, сероводорода, метана и другихпростых газов, а также сложных полимеров [ 4, 5].Данные об изучении микробиоты источникаАбаканский Аржан отсутствуют. Однако, согласносуществующим исследованиям, термальныеисточники со схожим химическим составом обладаютуникальным микробным сообществом, отдельныепредставители которого могут использоватьсядля создания микробных топливных элементов сцелью получения чистой энергии [5–8]. Микробныетопливные элементы – это биоэлектрическая система,включающая анод и катод, разделенные специальноймембраной, и применяющаяся с целью полученияэлектроэнергии по средствам окисления субстрата,находящегося в камере, с помощью микроорганизмов.Это перспективные и безопасные источники энергии.Данные установки схожи в техническом ис-полнении и применяемых материалах. Основойустановок является камера или цилиндр, содержащиепитательную среду или субстрат. Зависит это отштаммов микроорганизмов, которые применяютсяв технологии, а также от цели культивирования.Общий принцип работы микробных топливныхэлементов заключается в анаэробном окислениисубстрата биологическим материалом в аноднойкамере, отделенной от катодной ионоселективноймембраной. В результате микроорганизмы отдаютна анод электроны различными способами. Из-заперехода ионов, имеющих положительный заряд,в катодную область и скапливании электронов нааноде возникает разность потенциалов, генерирующаяэлектрический ток. Мембрана представляет собойнебольшой канал, который сужается посередине инаходится между катодной и анодной камерами.Она не дает смешиваться средам в камерах. Такимобразом, в анодной камере происходит окисление,а в катодной восстановление [9, 10].Электроны в микробных топливных элементахобразуются в процессе сложных биохимическихреакций, которые катализируются бактериями [6, 11].Выбор биокатализатора зависит от субстрата, которыйопределяет мощность и эффективность микробныхтопливных элементов. Исследовано микробноесообщество бактерий, которое вырабатывало до0,3 мА [12]. Бактерии, идентифицированные S. Ishiiи др. как относящиеся к роду Rhizobiales, составлялиосновную популяцию микробных топливныхэлементов, в котором в качестве единственногоисточника углерода выступала целлюлоза. Ученымиотмечалась уникальная морфология исследуемыхизолятов: наличие нитевидных придатков, которыеиграют важную роль в электрогенном сообществе,разлагающем целлюлозу. H. Rismani-Yazdi и др.для выработки энергии использовали микробноесообщество, выделенное из рубца крупного рогатогоскота [13]. В результате удалось достичь силы токав 1,5 мА. Однако генерируемая мощность микробныхтопливных элементов на основе подобных микробныхсообществ низкая.Интересными представляются результатыработ, авторы которых использовали бактерии,восстанавливающие металлы в качестве био-катализаторов в микробных топливных эле-ментах. К таким относят Geobacter, Shewanella,Rhodopseudomonas, Clostridium и др. [14–24].Серия исследований показала, что Geobacterи Shewanella используют электропроводящиевнеклеточные нити (нанопроволока) для переносаэлектронов на твердые акцепторы, такие какграфитовые аноды. Механизм переноса электроновхорошо изучен именно на примере указанныхродов. Данные микроорганизмы признаны модель-ными объектами при исследовании микробногоТаблица 1. Химический состав воды источникаАбаканский АржанTable 1. Chemical composition of water fromthe Abakan Arzhan springЭлемент Содержаниемг/л мг-экв/л экв-%Калий 2,00 ± 0,10 0,05 ± 0,01 1,00 ± 0,10Натрий 30,00 ± 0,50 1,33 ± 0,10 29,00 ± 0,50Магний 12,00 ± 0,30 1,00 ± 0,30 22,00 ± 0,45Кальций 43,00 ± 0,60 2,10 ± 0,10 47,00 ± 0,60Фтор – – –Хлор 21,00 ± 0,40 0,60 ± 0,05 13,00 ± 0,25Оксид серы 21,00 ± 0,40 0,45 ± 0,60 10,00 ± 0,20Гидрокарбонаты 214,00 ± 0,90 3,52 ± 0,15 77,00 ± 0,70Кремниевыекислоты75,00 ± 0,70 – –Минерализация 422,00 ± 0,80 – –461Дмитриева А. И. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2022. Т. 52. № 3. С. 458–468электросинтеза и металлоредукции [12, 25, 26].В основе переноса электронов ключевую рольиграют мультигемовые цитохромы. Это белки,которые обеспечивают перенос электронов отцитоплазматической мембраны бактериальнойклетки на внешнюю оболочку [27, 28]. Однакомногие базовые вопросы, касающиеся микробиологиигенерации электричества (микробного электросинтеза),до сих пор остаются без ответа.Микробные топливные элементы для производстваэлектроэнергии позволяют использовать разно-образные субстраты: от чистых соединенийдо сложных смесей органических веществ,присутствующих в сточных водах. Субстрат включаетв себя как органические, так и неорганическихматериалы. Существует множество субстратов,на которых могут расти экстремофильные бак-терии [14, 16, 18, 27]. Однако ученые сходятсяво мнении, что выращивать такие штаммы влабораторных условиях сложно, т. к. эволюционносообщества данных бактерий выживали в среде снедостатком водорода и кислорода, поэтому ихиспользование и культивирование в лабораторныхусловиях требует тщательного подхода и пониманияфакторов конкурентной борьбы микробиологическихсообществ за энергию [7, 14]. В лабораторияхприменяются методы, которые предполагаютвыращивание больших партий клеток и измерениеактивности белков. Это сложный и трудоемкийпроцесс. Другие методы основаны на разрушенииклеточных структур, очистке и исследованиибелков [18, 27, 28].В качестве питательной среды для таких штаммовучеными предлагается использовать либо стандартныелабораторные среды, либо отходы, содержащиеорганические соединения [3, 4, 13, 17].Целью настоящей работы является выявление ианализ бактериальных изолятов источника АбаканскийАржан для поиска ключевых продуцентов микробнойэнергии.Объекты и методы исследованияОбъектами исследования являлись образцыводы и ила термального источника АбаканскийАржан (Россия, Республика Хакасия, Таштыпскийрайон, 51°47›53.9»N 88°15›01.1»E) и полученныена следующих этапах исследований бактериальныеизоляты.Сбор образцов проводили в августе – сентябре2020 г. Пробы по 25 г ила и 25 мл воды отбиралив стерильные контейнеры. Площадь отбора однойточки составляла от 10 до 30 см2. Глубина отбора от10–30 см ниже уровня донных отложений (табл. 2).Каждый отбор производили в 3-х повторностях.Герметичные контейнеры с образцами хранили притемпературе 4,0 ± 0,5 °С до доставки в лабораторию.Для получения накопительных культуризолятов готовили 10 % суспензии образцов ивысевали на минимальные питательные среды. Вкачестве источника углерода и донора электроновв минимальных питательных средах использовали10 мМ ацетата, а также 40 мМ фумарата в качествеакцептора электронов.Общую микробную численность определялиметодом Коха. Чашки Петри инкубировали притемпературе 37 °С в течение 72 ч. Учитывали числоколоний, вырастающих при посеве 1 мл пробы начашку Петри.Морфологию изолятов, наличие пилей и чехланаблюдали с помощью электронного микроскопа (CarlZeiss, Германия) по стандартным методикам [29, 30].Также применяли люминесцентную микроскопию наинверсионном микроскопе AxioVert.A1 (Carl Zeiss,Германия) с применением красителя акридиновогооранжевого.Для выявления термотолерантных и экстре-мофильных изолятов чашки Петри инкубировалипри значениях температуры 30–60 °С с шагом 5 °С.Оптимум pH для изолятов определяли по методикеизмерения удельной скорости роста изолята .Выделенные изоляты подвергали консервациипри температуре –80 °С.Для выявления способности будущих изолятовк железоредукции использовали среды, которыесодержат Fe(CH3COO)3 и Fe(NO3)3, впервые предло-женные профессором D. RLovley для выращиванияжелезоредуцирующих бактерий, усовершенствованныев последующем [31]. Дополнительно к средедобавляли витамины, микроэлементы и дрожжевойэкстракт [32]. Инкубировали при 37,0 ± 0,5 °С втечение 72 ч, строго соблюдая анаэробные условияСО2 в инкубаторе ИЛМ-170-01 (Lamsystems, Россия).Методику определения способности штаммов кжелезоредукции подробно описали C. Merino и др. [33].Авторы использовали фотоколориметрическийметод, основанный на определении количества ионовжелеза (II). Для этого в 500 мкл среды, содержащейТаблица 2. Схема отбора образцов из источникаАбаканский АржанTable 2. Sampling scheme from the Abakan Arzhan spring№ ТипобразцаОбъем/массаГлубина отбора(для ила отуровня донныхотложений), смpH Температура,°С1 Вода 25 мл 30 6,8 26,52 Вода 25 мл 100 6,9 37,83 Вода 25 мл 300 7,2 40,04 Ил 25 г 10 7,1 25,55 Ил 25 г 20 7,2 30,06 Ил 25 г 30 7,5 31,7462Dmitrieva A.I. et al. Food Processing: Techniques and Technology. 2022;52(3):458–468суспензию изолятов, вносили равное количествоα,ά-дипиридила. Доводили объем до 3 мл и выдер-живали в темном месте в течение 30 мин. После образцыисследовали на фотоэлектроколориметре при длиневолны 540 нм и определяли концентрацию ионовFe2+ в мг/л с помощью построения калибровочногографика.Для метагеномного анализа микробногосообщества экстрагировали нуклеиновые кислотыиз образцов с использованием наборов DNEasyPowerSoil Kit и RNeasy PowerSoil Total RNA Kit(Qiagen, Германия). Выделение проводили согласнопротоколам производителя.Для экстракции нуклеиновых кислот из нако-пительных культур использовали наборы DNEasyKit и RNeasy Kit (Qiagen, Германия). Выделениепроводили согласно протоколам производителя.Качество выделенных нуклеиновых кислот иоценку целостности РНК определяли на системекапиллярного электрофореза с автосемплером на8 образцов Qsep1 (Bioptic, Тайвань).Амплификацию выделенных фрагментовпроводили прямым методов, согласно протоколу,описанному G. Muyizer с коллегами [34].Для амплификации 16 S РНК использовалипраймеры 27F (5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)и 1525R (5’-AAGGAGGTGWTCCARCC) [30, 35].Полимеразную цепную реакцию проводили наамплификаторе АНК-32 (Синтол, Россия) в режимереального времени при следующих условиях: цикл при94 °С для денатурации двуцепочечной молекулы ДНКв течение 5 мин, затем 30 циклов при 95 °С в течение0,5 мин, 55 °С в течение 0,5 мин, 72 °С в течение1,5 мин и заключительный этап удлинения при 72 °Св течение 10 мин. Для рестрикции использовалиHaeIII, HhaI, MnlI, Sau3AI, TaqI.Секвенирование нуклеотидных последователь-ностей проводили на платформе MiSeq (Illumina,США) с применением NGS технологий. Дляработы использовали готовый набор реагентов отпроизводителя Reagent Kit v3 (Illumina, США). Работувели по протоколам прибора c незначительнымимодификациями.Биоинформатический анализ нуклеотидныхпоследовательностей 16S рРНК проводили по базеданных NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov), используяалгоритм BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Вслучае необходимости проводили редактированиеполученных последовательностей с помощью BioEdit(http://jwbrown.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html).Для анализа 16S РНК микробиотического сооб-щества использовали библиотеку Silva (https://www.arb-silva.de), где представлены комплексные,проверенные на качество и регулярно обновляемыенаборы данных выровненных последовательностеймалых (16S/18S, SSU) и больших субъединиц (23S/28S,LSU) рибосомных РНК (рРНК) для трех доменов:бактерии, археи и эукариоты [36].Филогенетический анализ проводили с исполь-зованием программы MEGA11 (https://www.megasoftware.net).Статистическую обработку данных проводилипо стандартным методикам с использованиемТаблица 3. Разнообразие представителей таксона Bacteria в пробах воды и илаTable 3. Bacterial diversity in water and silt samplesНомер пробы 1 2 3 4 5 6Филотип Процент от общего числа последовательностей в библиотеке, %Firmicutes 34,674 23,456 54,254 34,567 29,755 13,194Bacteroides 14,973 9,082 11,493 2,973 3,083 2,194Thiobacillus – – – – – 1,038Betaproteobacteria – – – 0,234 6,234 25,992Thermomonas 0,274 3,682 10,763 15,972 17,254 45,723Gammaproteobacteria – – 3,742 10,234 10,422 16,274Proteobacteria 56,962 48,862 36,872 62,722 45,724 33,834Actinobacteria – – 3,761 5,621 – 10,672Минорные филотипы Процент от общего числа последовательностей в библиотеке, %Sulfurospirillum – – – 0,001 – –Geobacter 0,001 0,001 0,004 0,001 0,029 0,085Shewanella – – 0,001 0,003 0,078 0,098Pseudomonas – 0,001 0,001 – – –Achromobacter – – 0,001 – – 0,001Clostridium – – – – – –463Дмитриева А. И. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2022. Т. 52. № 3. С. 458–468программного пакета Microsoft Excel 2010 дляWindows 7. Для полученных данных рассчитывалисреднее значение и стандартное отклонение.Результаты и их обсуждениеРезультаты исследования бактериального разно-образия филотипов в образцах воды и ила приведеныв таблице 3.В таблице 3 представлены данные по филотипам,для которых средних процент находки выше 1 %.Доминирующими филотипами, которые удалосьустановить для проб воды, являются Firmicutes,Bacteroides и Proteobacteria, для проб ила – Firmicutes,Thermomonas, Gammaproteobacteria и Proteobacteria.C целью упрощения поиска железоредуцирующихизолятов был произведен анализ минорных фило-типов, который подтвердил присутствие в пробахРНК Geobacter и Shewanella, в меньшем количестве –Pseudomonas, Sulfurospirillum и Achromobacter.Общее количество полученных накопительныхкультур из образцов, собранных на источникеАбаканский Аржан, – 9. Данные исследованияморфологических и физиологических свойствпредставлены в таблице 4.В ходе изучения морфологических ифизиологических характеристик изолятов инте-ресными с точки зрения дальнейших исследо-ваний представляются изоляты № 1 и 2. Данныепредставители микробиоты термального источникаАбаканский Аржан обладают выраженнымиэкстремофильными свойствами: рост на среде сpH 8,0–8,5, рост при температуре 40 ± 2 и 45 ± 2 °Ссоответственно. На рисунке 1 представлены два видаустойчивых колонии (изоляты № 1 и 2) на плотнойпитательной среде. Состав указан в [31].Морфологические характеристики изолятовпредставлены на рисунке 2.Оба изолята на разных стадиях роста имелипалочковидную форму. Средняя длина и ширина клетокизолята № 1 составила 4,50 ± 0,08 и 0,80 ± 0,03 мкм,изолят № 2 обладал средней длиной и шириной2,20 ± 0,05 и 0,60 ± 0,02 мкм соответственно. Дляизолята 2 наблюдалась незначительное образо-вание диплолочковидных клеток при переходеТаблица 4. Морфологические и физиологические свойства изолятовTable 4. Morphological and physiological properties of isolatesИзолятСвойства№ 1 № 2 № 3 № 4 № 5 № 6 № 7 № 8 № 9Длинаклетки,мкм4,50 ± 0,08 2,20 ± 0,05 0,80 ± 0,01 2,80 ± 0,02 3,20 ± 0,06 1,90 ± 0,01 0,70 ± 0,01 2,70 ± 0,05 2,20 ±0,05Наличиечехла– – – – – – – – –ОптимальноезначениерН8,0–8,5 8,0–8,5 7,0–8,0 7,0–8,0 6,0–6,5 7,0–8,0 7,5–8,5 7,0–8,0 7,0–8,0Оптимальнаятемпература,°С40 ± 2 45 ± 2 35 ± 2 33 ± 2 37 ± 2 36 ± 2 33 ± 2 37 ± 2 37 ± 2Аэробныйрост втемноте+ + + – – – + + –Наличиепилей+ + – – ± – ± – –«+» – присутствие признака; «–» – отсутствие признака; «±» – сомнительный признак.“+” – sign detected; “–” – no sign detected; “±” – a doubtful s ignРисунок 1. Изоляты, полученные на среде, содержащейFe(CH3COO)3) и Fe(NO3)3. Изображение колоний после48 ч инкубацииFigure 1. Isolates obtained on a medium containing Fe(CH 3COO)3and Fe(NO3)3 after 48 h of incubationИзолят № 1 Изолят № 2464Dmitrieva A.I. et al. Food Processing: Techniques and Technology. 2022;52(3):458–468в экспоненциальную стадию роста. Подобныеклетки представляют собой недавно разделившиесяклетки.Рост на среде, содержащей ацетат железа (III)и нитрат железа (III), свидетельствует о процессеFe(III)-восстановления у исследуемых изолятов. Нарисунке 3 представлено содержание ионов Fe(II),мкг/мл, в зависимости от изолята .Очевидны железоредуцирующие свойствавыделенных изолятов. С увеличением временикультивирования содержание ионов железа зна-чительно повышается. Это связано с процессомFe(III)-восстановления в исследуемых образцах. Награфиках роста содержания ионов Fe(II) заметныстатистические отклонения, которые появляютсячерез 48 ч культивирования. Авторы объясняют этоотличиями в способности штаммов к железоредукции.Интенсивнее восстановление железа проходит вобразце с изолятом № 2 после 72 ч культивирования(409 мкг/мл). Однако изолят № 1 также показалсущественные редуцирующие свойства спустя72 ч – 407 мкг/мл. Интересна разница показателейпри достижении 48 ч культивирования: изолят№ 2 – 250 мкг/мл, изолят 1 – всего 165 мкг/мл.Культивирование более 72 ч является нецеле-сообразным, т. к. результаты исследования под-тверждают наличие железоредуцирующих свойству исследуемых изолятов.Филогенетический анализ изолятов, основанныйна сравнении нуклеотидных последовательностей16S РНК, показал, что штаммы близки между собойи относятся к известным видам (рис . 4 и 5).Данные филогенетического анализа 16S РНКпозволяют отнести изолят № 1 к роду Shewanella,а изолят № 2 к роду Geobacter. Оба этих таксонавключают в себя обширные группы сульфид- и желе-зоредуцирующих бактерий, способных накапливатьэлектрический заряд на своей поверхности [32, 37].Таким образом, из источника Абаканский Аржанудалось выделить 2 вида железоредуцирующихбактерий: Shewanella algae и Geobacter sulfurreducens.ВыводыПроблема выработки чистой энергии насегодняшний день стоит крайне остро. Вернымс точки зрения экологии и защиты окружающейсреды является применение технологий микробногосинтеза электроэнергии. Этот способ производстваэлектричества основывается на способности штаммовмикроорганизмов генерировать протоны водородав среде, содержащей необходимый субстрат. Приэтом эмиссия CO2 отсутствует. Некоторые микро-организмы-экстремофилы способны потреблятьорганические вещества и генерировать энергию.Интерес представляет микробиота горячих источников.По известным данным роды Shewanella и Geobacterимеют электропроводящие отростки, облегчающиепрямой перенос электронов. Они способны превращатьорганические отходы, в том числе токсичные, вменее опасные вещества и производить в процессеэлектричество.Если эта система будет усовершенствована, томикроорганизмы помогут решить две взаимосвязанныеглобальные проблемы – загрязнение окружающейсреды и получение чистой энергии.В ходе изучения микробного сообщества тер-мального источника Абакаский Аржан установлено,что доминирующими филотипами являются Firmicutes,Bacteroides и Proteobacteria, Firmicutes, Thermomonas,Gammaproteobacteria и Proteobacteria. Удалось уста-новить наличие схожих последовательностей 16S РНКдля филотипов Shewanella и Geobacter в собранныхобразцах. Это подтверждает теорию о присутствиижелезоредуцирующих видов в образцах.Рисунок 2. Морфология изолятов в логарифмическойстадии роста культур: a – изолят № 1; b – изолят № 2.Данные электронной микроскопии, ×100Figure 2. Morphology of isolates in the logarithmic stage ofculture growth: a – isolate 1; b – isolate2. Electron microscopy, ×100a bРисунок 3. Зависимость содержания ионов Fe(II)от изолята и продолжительности культивированияFigure 3. Effect of isolate and cultivation time on the contentof Fe(II) ions050100150200250300350400450Изолят № 1 Изолят № 2Содержание ионов Fe(II), мгк/л24 ч 48 ч 72 ч465Дмитриева А. И. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2022. Т. 52. № 3. С. 458–468Эксперименты по изоляции отдельных видовмикробного сообщества позволили получить9 накопительных культур, 2 из которых показалирост на среде, содержащей ацетат железа (III) инитрат железа (III). Это свидетельствует о процессеFe(III)-восстановления. Интенсивнее восстановлениежелеза проходило в образце с изолятом № 2 (Geobactersulfurreducens) после 72 ч культивирования(409 мкг/мл). Однако изолят № 1 (Shewanellaalgae) также показал существенные редуцирующиеРисунок 4. Филогенетическое древо изолята № 1, построенное с помощью метода максимального правдоподобия(Maximum Likelihood). Масштаб эволюционных расстояний соответствует 2 заменам на100 аминокислот последовательностиFigure 4. Phylogenetic tree of isolate 1 by the Maximum Likelih ood method. Evolutionary scale: two substitutions per 100 amino acidsРисунок 5. Филогенетическое древо изолята № 2, построенное с помощью метода максимального правдоподобия(Maximum Likelihood). Масштаб эволюционных расстояний соответствует 2 заменам на100 аминокислот последовательностиFigure 5. Phylogenetic tree of isolate 2 by the Maximum Likelih ood method. Evolutionary scale: two substitutions per 100 amino acids466Dmitrieva A.I. et al. Food Processing: Techniques and Technology. 2022;52(3):458–468свойства 407 мкг/мл. Исходя из представленныхданных, актуальным представляется использованиеи дальнейшее изучение двух видов изолятов,определенных в результате филогенетическогои биоинформатического анализов как S. algae иG. sulfurreducens.Представленные результаты исследования леглив основу дальнейших экспериментов, направленныхна изучение процесса микробного электросинтеза спомощью выделенных изолятов экстремофильныхбактерий, а также на конструирование пробногообразца микробных топливных элементов иинтенсификацию процесса микробного электро-синтеза.Ближайшие аналоги данной технологии пред-лагают использовать экстремофильные штаммы,не способные активно потреблять органическиесубстраты. Следовательно, основными отличиямитехнологии являются не только возможностьполучения электроэнергии с помощью микробногосинтеза, но и переработка сложных органическихотходов (включая нативные субстраты сельскогохозяйства: коллаген, кератин, эластин). Такимобразом, конечной целью применения технологиимикробного синтеза авторы ставят утилизацию иочистку сточных вод пищевых и перерабатывающихпредприятий [38].Критерии авторстваА. И. Дмитриева руководила научной работой иобеспечивала выполнение экспериментальной частив области молекулярно-биологических исследований.М. Ю. Дроздова и Е. Р. Фасхутдинова обеспечиваливыполнение лабораторной части экспериментов поисследованию морфологических и физиологическихпризнаков, а также выделению накопительныхкультур экстремофльных изолятов. С. С. Кутузови Л. А. Проскурякова обеспечивали подготовкуаналитической части исследования.Конфликт интересовАвторы заявляют об отсутствии конфликтаинтересов.ContributionA.I. Dmitrieva supervised the research and performedthe experimental part in the field of molecular biologicalresearch. M.Yu. Drozdova and E.R. Faskhutdinovawere responsible for the laboratory study of morphologicaland physiological characteristics, as well as theisolation of enrichment cultures of extreme isolates.S.S. Kutuzov and L.A. Proskuryakova provided theanalytical part of the study.Conflict of interestThe authors declare that there is no conflict of interestregarding the publication of this article.