INFLUENCE OF VITAMINS ON GROWTH AND DEVELOPMENT OF MYCELIUM OF SOME BASIDIOMYCETES IN LIQUID MEDIUM
Rubrics: FOOD PRODUCTION TECHNOLOGY
Authors:
1.
Biysk Technological Institute (branch), Altai State Technical University named after I.I. Polzunova
2.
Biysk Technological Institute (branch), Altai State Technical University named after I.I. Polzunova
3.
Biysk Technological Institute (branch), Altai State Technical University named after I.I. Polzunova
4.
Biysk Technological Institute (branch), Altai State Technical University named after I.I. Polzunova
Type:
Article
Pages:
from 43
to 49
Status:
Published
Received:
30.12.2016
Accepted:
30.12.2016
Published:
30.12.2016
Subject area:
UDK 66 Химическая технология. Химическая промышленность. Родственные отрасли
UDK 60 Прикладные науки. Общие вопросы
UDK 60 Прикладные науки. Общие вопросы
Language:
Russian
Keywords:
Vitamins, stationary conditions, growth rate, mycelium biomass
Abstract (English):
The relevance of the research is to study the need for new strains of edible mushrooms for accumulation of mycelia biomass which would create the optimum physiological culture conditions to achieve high and stable yield of biomass. One way to increase the yield of high quality mycelium can be administering vitamins at different stages of fungi ontogenesis. The aim of the research was to study the effect of vitamins on growth and development of the mycelium of Armillaria mellea (Vahl: Fr.) P. Kumm and Lentinula edodes (Berk.) Pegler F-1000 when cultured under stationary conditions. The biomass of the mycelium has been obtained on a liquid nutrient medium composed of 1.0% of glucose, 0.5% of peptone main dry, 1.1% of KH2PO4, 0.1% of MgSO4 × 7H2O, 97.3% of H2O (dist.). To study the effect of vitamins on the growth of mycelium of fungi cultures of A. mellea and L. edodes we used riboflavin (LSR-002944/07), thiamine (LSR-002679/07), nicotinic acid (LSR-015076/01), vitamin C (LSR-000781/08) and a mixture of four vitamins in a glucose-peptone medium at concentrations of 0.15, 0.20, 0.40, 0.60 and 0.80 mg/ml. As a result, comparing the data obtained on the control and fortified media, both positive and negative effects of adding vitamins on the growth rate and the development of A. mellea mycelium and L. edodes have been established. The kinetic and condition-growing indices of mycelium A. mellea and L. edodes have been found. It has been stated that riboflavin and thiamine have a stimulating effect on the intensification of mycelium growing processes in A. mellea and L. edodes . Using these vitamins in optimum concentration of 0.20 mg/ml allows increasing the average daily rate of growth of mycelium A. mellea vs. a control one in 1.44-1.46 times. Nicotinic acid and vitamin C demonstrate low stimulating efficiency on the growth of A. mellea and L. edodes .
The relevance of the research is to study the need for new strains of edible mushrooms for accumulation of mycelia biomass which would create the optimum physiological culture conditions to achieve high and stable yield of biomass. One way to increase the yield of high quality mycelium can be administering vitamins at different stages of fungi ontogenesis. The aim of the research was to study the effect of vitamins on growth and development of the mycelium of Armillaria mellea (Vahl: Fr.) P. Kumm and Lentinula edodes (Berk.) Pegler F-1000 when cultured under stationary conditions. The biomass of the mycelium has been obtained on a liquid nutrient medium composed of 1.0% of glucose, 0.5% of peptone main dry, 1.1% of KH2PO4, 0.1% of MgSO4 × 7H2O, 97.3% of H2O (dist.). To study the effect of vitamins on the growth of mycelium of fungi cultures of A. mellea and L. edodes we used riboflavin (LSR-002944/07), thiamine (LSR-002679/07), nicotinic acid (LSR-015076/01), vitamin C (LSR-000781/08) and a mixture of four vitamins in a glucose-peptone medium at concentrations of 0.15, 0.20, 0.40, 0.60 and 0.80 mg/ml. As a result, comparing the data obtained on the control and fortified media, both positive and negative effects of adding vitamins on the growth rate and the development of A. mellea mycelium and L. edodes have been established. The kinetic and condition-growing indices of mycelium A. mellea and L. edodes have been found. It has been stated that riboflavin and thiamine have a stimulating effect on the intensification of mycelium growing processes in A. mellea and L. edodes . Using these vitamins in optimum concentration of 0.20 mg/ml allows increasing the average daily rate of growth of mycelium A. mellea vs. a control one in 1.44-1.46 times. Nicotinic acid and vitamin C demonstrate low stimulating efficiency on the growth of A. mellea and L. edodes .
Keywords:
Vitamins, stationary conditions, growth rate, mycelium biomass
Vitamins, stationary conditions, growth rate, mycelium biomass
Введение Основной проблемой при производстве мицелия съедобных грибов является создание оптимальных физиологических условий культивирования для достижения высокого и стабильного выхода биомассы [1, 12]. Прежде всего это касается решения проблем высокой скорости роста мицелия и продуктивности. Одним из способов увеличения выхода высококачественного мицелия может быть введение витаминов на разных этапах онтогенеза грибов [2, 3]. Многие авторы в своих работах показали стимулирующую роль витаминов [3, 6, 7]. По их мнению, они эффективны в очень малых дозах и имеют специфическое действие на определенные этапы обмена веществ [7, 9, 10, 11]. Сапротрофные грибы по отношению к витаминам разделяют на две группы: витаминоауксогетеротрофные, у которых отсутствует способность синтезировать необходимые для них витамины, и витаминоауксотрофные, обладающие способностью синтезировать требуемые витамины при росте в питательной среде [2]. При этом большинство сапротрофных грибов относятся к витаминоауксотрофной группе. Однако такое распределение на группы носит условный характер, так как при добавлении в питательную среду витаминов усиливается рост мицелия и ауксотрофных грибов [3-6]. Витамины имеют большое значение для онтогенеза грибов, а именно: входят в состав биологически активных органических соединений; участвуют в стабилизации коллоидных частиц и макромолекул, создавая определенные ионные концентрации; участвуют в каталитических реакциях, входя в состав отдельных ферментов [2]. Для сапротрофных грибов витамины требуются в очень низких концентрациях (0,0001 до 1 мг/мл). Потребность грибов в витаминах может ограничиваться всего одним или может быть комплексной, включающей до 5-7 различных витаминов. Иногда витамины заменяются их предшественниками (например, тиамин - пиримидином и тиазолом). У некоторых видов грибов существуют одинаковые потребности в витаминах, к примеру, многие виды нуждаются в полной молекуле тиамина. В то же время у некоторых видов наблюдается полная ауксотрофность. Особенно тесной связи между потребностями грибов в витаминах и их экологией не наблюдается. Ауксогетеротрофность может быть связана с паразитизмом, симбиозмом или антропогенным фактором [5]. Грибы больше всего нуждаются в водорастворимых витаминах группы B и особенно в тиамине. Потребность грибов в тиамине впервые обнаружена Шопфером и Бургеффом в 1934 г. Потребность в тиамине встречается у очень многих сапротрофных грибов. Избыток тиамина в питательной среде вызывает ингибирование роста грибов, что связано с накоплением в культуре грибов этилового спирта в результате декарбоксилирования пирувата. При недостатке тиамина в среде нуждающихся в нем грибов наблюдается избыточное накопление в ней пирувата. Помимо тиамина, некоторые сапротрофные грибы нуждаются в рибофлавине, никотиновой кислоте и витамине С [2]. Рибофлавин состоит из изоаллоксазинового ядра и спирта рибитола - производного рибозы. Этот витамин является второй простетической группой ряда дегидрогеназ, где активной группой является флавинаденинмононуклеотид; принимает участие в первом этапе пути метаболизма гексоз через гексозомонофосфат, окисляя глюконовую кислоту и глюкозу [6]. Рибофлавин хорошо синтезируется некоторыми сапротрофными грибами, вследствие чего они могут служить источниками для промышленного получения этого витамина [3]. Никотиновая кислота представляет собой производное пиридина с замещенным карбоксильной группой водородом по атому C3 [11], участвует практически во всех реакциях дегидрогенизации и гидрогенизации; принимает участие в каталитических реакциях ферментов, восстанавливающих нитраты при образовании макроэргических фосфатов в процессе окислительного фосфорилирования [10]. Витамин С имеет структуру, сходную с кетосахарами, и его функции связаны со способностью легко окисляться в дегидроаскорбиновую кислоту. Некоторые сапротрофные грибы хорошо синтезируют аскорбиновую кислоту по ксилулозному пути углеводного обмена через промежуточные стадии гулоновой и глюкуроновой кислот. В настоящее время биологическая роль витаминов еще мало изучена на базидиомицетах, но, судя по имеющимся литературным данным, она весьма значительна [2, 3]. В связи с этим целесообразно исследовать влияние витаминов на процесс получения мицелия съедобных грибов. Целью работы являлось изучение влияния витаминов на рост и развитие мицелия Armillaria mellea (Vahl: Fr.) P. Kumm и Lentinula edodes (Berk.) Pegler при культивировании в стационарных условиях. Объекты и методы исследований Объектами исследования были штамм L. edodes F-1000, приобретенный через интернет-магазин (http://www.stolbovo.ru), и чистая культура гриба A. mellea, выделенная из плодовых тел, собранных с пней березы повислой (Betula pendula) в естественных местообитаниях Алтайского края. Идентификация вида A. mellea осуществлялась по определителю грибов [8]. Выделение A. mellea в чистую культуру проводилось из тканей свежесобранных грибов по методике, описанной А.С. Бухало [5]. В настоящее время подана заявка на идентификацию штамма. Результаты исследований будут приведены в последующих публикациях. Выращивание культур грибов осуществляли в чашках Петри методом поверхностного культивирования на сусло-агаре при температуре 28 °C до полного зарастания мицелием питательной среды. Хранили культуры на скошенной сусло-агаровой среде в пробирках при температуре (4±1) °C. Биомассу мицелия получали в стационарных условиях на жидкой питательной среде состава: глюкоза - 1,0 %, пептон основной сухой - 0,5 %, КН2РО4 - 1,1 %, МgSO4×7Н2О - 0,1 %, Н2О (дистил.) - 97,3 %. Для культивирования использовались колбы емкостью 500 мл с объемом среды 250 мл. Стерилизацию раствора пептона и солей осуществляли автоклавированием при избыточном давлении 0,12 МПа, раствор глюкозы при 0,05 МПа в течение 30 мин. Для получения инокулята выращенный в чашках Петри на сусло-агаре мицелий вносили в колбы со стерильной жидкой средой (диаметр колоний 10 мм) и культивировали в стационарных условиях. Выращенный мицелий стерильно гомогенизировали и вносили в колбы для культивирования, объемная доля составляла 10 %. При получении мицелия в стационарных условиях использовали термостат (ТС-80М-20). Биомассу мицелия собирали и высушивали в сушильном шкафу (СНОЛ-3,5) при температуре 55 °С до постоянной массы и измельчали. Для изучения влияния витаминов на рост мицелия культур грибов A. mellea и L. edodes использовали: рибофлавин (ЛСР-002944/07), тиамин (ЛСР-002679/07), никотиновую кислоту (ЛСР-015076/01), витамин C (ЛСР-000781/08) и смесь четырех витаминов с концентрациями в глюкозо-пептонной среде (ГПС) 0,15; 0,20; 0,40; 0,60 и 0,80 мг/мл. Для получения мицелия в стационарных условиях использовали термостат (ТС-80М-20). Накопление биомассы оценивалось по воздушно-сухой массе (10 % влажность) мицелия. Вычисление скорости линейного роста колонии проводили по формуле V = (D - d)/t, где D - диаметр колонии, мм; d - диаметр инокуляционного блока, мм; t - продолжительность культивирования, сутки [7]. Определение редуцирующих сахаров проводили по ГОСТ 12575-2001. Процесс роста мицелия контролировали по интенсивности потребления сахаров в среде. Накопление биомассы прекращали при снижении концентрации редуцирующих веществ до 0,4 % и менее. Эксперимент проводили в 3-кратной повторности. Статистическая обработка данных проводилась с использованием компьютерной программы Microsoft Excel 2010. Результаты и их обсуждение Одним из основных показателей, определяющих экономическую эффективность той или иной биотехнологии, является продолжительность процесса получения целевого продукта [11, 12]. Поэтому при изучении влияния витаминов на рост мицелия важным этапом является изучение динамики его накопления при культивировании на жидкой среде. На ГПС увеличение биомассы мицелия A. mellea и L. edodes в зависимости от времени культивирования отображается S-образными кривыми, что характерно для роста базидиальных грибов [10]. Анализ полученных зависимостей позволяет выделить у видов A. mellea и L. edodes пять фаз роста. I фаза (лаг-фаза) характеризуется самым низким приростом биомассы. Известно, что в этот период развития происходит настройка ферментной системы организма на компоненты питательной среды [12]. Длительность лаг-фазы у A. mellea составляет 4 суток, тогда как у L. edodes 2 суток. Скорость роста мицелия возрастает, и наступает II - фаза роста (фаза ускорения), период которой у видов A. mellea и L. edodes на ГПС длится 2 суток. Затем рост мицелия переходит в III - фазу экспоненциального роста, в которой жизненная активность мицелия A. mellea и L. edodes становится заметно выше при сравнении с другими фазами роста. Продолжительность III фазы у A. mellea составляет 20 суток, в то время как у L. edodes - 6 суток. Считается, что в этой фазе наблюдается максимальная скорость роста мицелия [11]. После экспоненциальной фазы рост мицелия переходит в IV - фазу замедления. Известно, что уменьшение скорости роста мицелия связано с действием лимитирующих факторов среды - исчерпание питательных веществ и накопление метаболитов в замкнутой системе [12]. При наступлении V - фазы стационарного роста нарастание биомассы практически прекращается (рис. 1). Максимальный выход мицелия у A. mellea был получен на 28 сутки и составлял 26,48 г/л, у L. edodes на 12 сутки культивирования - 8,00 г/л. Наблюдения за ростом культур A. mellea и L. edodes в присутствии витаминов позволили получить следующие результаты, представленные в табл. 1. Таблица 1 Количество биомассы и среднесуточная скорость роста мицелия видов A. mellea и L. edodes при внесении в ГПС витаминов № Концентрации, мг/мл Количество биомассы, г/л % к контролю по биомассе мицелия Скорость роста, мм/сут. % к контролю по скорости роста A. mellea L. edodes A. mellea L. edodes Рибофлавин 1 0,15 26,55 9,55 100,3 119,4 2,95 7,12 118,0 100,3 2 0,20 28,30 10,10 106,9 126,3 3,64 7,20 145,6 101,4 3 0,40 27,10 9,50 102,3 118,8 3,20 7,25 128,0 102,1 4 0,60 24,00 8,20 90,6 102,5 2,94 7,20 117,6 101,4 5 0,80 22,45 7,86 84,7 98,2 2,65 7,18 106,0 101,1 6 Контроль 26,48 8,00 100 100 2,50 7,10 100 100 Тиамин 1 0,15 26,42 8,94 99,7 111,7 3,00 7,10 120,0 100,0 2 0,20 26,94 10,60 101,7 132,5 3,60 7,15 144,0 100,7 3 0,40 26,72 10,80 100,9 135,0 3,10 7,20 124,0 101,4 4 0,60 21,10 9,00 79,6 112,5 2,86 7,15 114,4 100,7 5 0,80 21,00 8,20 79,3 102,5 2,60 7,10 104,0 100,0 6 Контроль 26,48 8,00 100 100 2,50 7,10 100 100 Никотиновая кислота 1 0,15 22,40 6,10 84,5 76,2 2,60 7,10 104,0 100,0 2 0,20 25,10 6,20 94,7 77,5 2,70 7,17 108,0 100,9 3 0,40 24,80 6,18 93,6 77,2 2,76 7,15 110,4 100,7 4 0,60 19,00 5,94 71,7 74,2 2,40 7,12 96,0 100,3 5 0,80 18,60 5,90 70,2 73,7 2,40 7,05 96,0 98,9 6 Контроль 26,48 8,00 100 100 2,50 7,10 100 100 Витамин C 1 0,15 21,50 6,90 81,2 86,2 2,46 7,12 98,40 100,2 2 0,20 22,60 6,94 85,3 86,7 2,54 7,16 101,6 100,8 3 0,40 23,20 6,80 87,6 85,0 2,50 7,10 100,0 100,0 4 0,60 21,46 6,74 81,0 84,2 2,30 7,06 92,00 99,40 5 0,80 18,40 6,65 69,5 83,1 2,20 7,02 88,00 98,87 6 Контроль 26,48 8,00 100 100 2,50 7,10 100 100 Смесь витаминов 1 0,15 26,10 6,48 98,5 81,0 2,75 7,12 110,4 100,2 2 0,20 27,10 6,54 102,3 81,7 2,90 7,17 116,0 100,9 3 0,40 26,20 6,40 98,9 80,00 2,80 7,20 112,0 101,4 4 0,60 23,00 6,35 86,8 79,4 2,55 7,10 102,0 100,0 5 0,80 22,90 6,20 86,5 77,5 2,50 7,10 100,0 100,0 6 Контроль 26,48 8,00 100 100 2,50 7,10 100 100 Примечание: относительная погрешность для биомассы мицелия ±0,2 г/л; для скорости роста ±0,1 мм/сут Из данных табл. 1 видно, что максимальная биомасса мицелия A. mellea на ГПС с рибофлавином в концентрации 0,20 мг/мл и составляла 28,30 г/л уже через 20 суток культивирования, в то время как примерно такое же значение биомассы в контроле достигалось лишь через 28 суток. Стимулирующий эффект в той же концентрации наблюдался с добавлением в ГПС тиамина и смеси витаминов, биомасса мицелия A. mellea при сравнении с контролем также различалась незначительно и составила 26,94 и 27,10 г/л через 20 и 24 суток соответственно (рис. 1). Характер роста мицелия A. mellea с добавлением этих витаминов существенно отличается от контроля сокращением экспоненциальной фазы роста. Добавление в ГПС никотиновой кислоты и витамина C с концентрациями 0,15; 0,20; 0,40; 0,60 и 0,80 мг/мл, а также рибофлавина и тиамина с концентрациями свыше 0,60 мг/мл вызывало ингибирование роста мицелия по отношению к контролю. Рис. 1. Динамика накопления биомассы мицелия A. mellea на ГПС с добавлением витаминов: I - лаг-фаза; II - фаза ускорения; III - экспоненциальная фаза; IV - фаза замедления; V - стационарная фаза Использование рибофлавина и тиамина с концентрацией 0,20 мг/мл в ГПС позволяет увеличить среднесуточную скорость роста в сравнении с контролем в 1,44-1,46 раза соответственно (рис. 2) и достичь стационарной фазы роста на 8 суток раньше. Рис. 2. Среднесуточная скорость роста культуры A. mellea на ГПС с добавлением витаминов При выборе витаминов для культивирования L. edodes также следует отдавать предпочтение рибофлавину (0,20 мг/мл) и тиамину (0,40 мг/мл) (рис. 3), увеличение биомассы мицелия в сравнении с контролем в 1,26-1,35 раза соответствен-но. Показано, что накопление биомассы на среде с рибофлавином не уступает таковому на среде с тиамином. По длительности культивирования и достижения стационарной фазы роста существенных различий в сравнении с контролем не обнаружено. Время культивирования в опытных и в контрольном вариантах составляло 10 суток. Биомасса мицелия, полученная на ГПС с никотиновой кислотой, витамином C и смесью витаминов в концентрациях 0,15; 0,20; 0,40; 0,60 и 0,80 мг/мл была ниже, чем в контроле (табл. 1). Среднесуточная скорость роста мицелия L. edodes с добавлением в ГПС этих витаминов мало отличалась от контроля (рис. 4). Рис. 3. Динамика накопления биомассы мицелия L. edodes на ГПС с добавлением витаминов: I - лаг-фаза; II - фаза ускорения; III - экспоненциальная фаза; IV - фаза замедления; V - стационарная фаза Рис. 4. Среднесуточная скорость роста культуры L. edodes на ГПС с добавлением витаминов Таким образом, при сравнении данных, полученных на контрольной и витаминизированных средах, было установлено как положительное, так и отрицательное влияние добавления витаминов в концентрациях 0,15; 0,20; 0,40; 0,60 и 0,80 мг/мл в ГПС на скорость роста и развития мицелия A. mellea и L. edodes. Выводы 1. Определены кинетические и продукционные показатели выращивания биомассы мицелия A. mellea и L. edodes на ГПС с добавлением витаминов в стационарных условиях. 2. Установлено, что рибофлавин и тиамин оказывают стимулирующее действие на интенсификацию ростовых процессов у мицелия A. mellea и L. edodes. При использовании оптимальной концентрации этих витаминов (0,20 мг/мл) достигалось увеличение среднесуточной скорости роста мицелия A. mellea в 1,44-1,46 раза. 3. Никотиновая кислота, витамин С и смесь витаминов не оказывали существенного влияния на рост A. mellea и L. edodes. 4. Максимальное накопление биомассы A. mellea было отмечено на среде с рибофлавином (0,20 мг/мл) и составляло 28,30 г/л через 20 суток культивирования. 5. Наибольшая биомасса у L. edodes наблюдалась на ГПС с тиамином (0,30 мг/мл) и составляла 10,80 г/л через 10 суток культивирования.
1. Bekker, Z.E. Fiziologiya i biohimiya gribov / Z.E. Bekker. - M.: Izd-vo Moskovskogo universiteta, 1988. - 227 s.
2. Vliyanie guminovyh stimulyatorov rosta na rost miceliya veshenki obyknovennoy Pleurotus ostreatus / O.A. Evdokimova, S.V. Pol'skih, V.E. Aksenovskaya [i dr.] // Organizaciya i regulyaciya fiziologo-biohimicheskih processov. - Voronezh: VGU, 2000. - 58 c.
3. Belova, N.V. Perspektivy ispol'zovaniya biologicheski aktivnyh soedineniy vysshih bazidiomicetov v Rossii / N.V. Belova // Mikol. i fitopatol. - 2004. - T. 38, vyp. 2. - S. 1-7.
4. Vasser, S.P. Biologicheskie osobennosti lekarstvennyh makromicetov v kul'ture / pod red. S.P. Vassera. - K.: Al'tepres, 2011. - T. 2. - 212 s.
5. Kul'tivirovanie s'edobnyh i lekarstvennyh gribov. Prakticheskie rekomendacii / A.C. Buhalo, N.A. Bis'ko, E.F. Solomko [i dr.]; pod red. A. S. Buhalo. - K.: Chernobyl'interinform, 2004. - 128 s.
6. Il'ina, G.V. Biologicheskie osobennosti vidov ksilotrofnyh bazidiomicetov lesostepi Pravoberezhnego Povolzh'ya insitu i exsitu / G.V. Il'ina, Yu.S. Lykov // Povolzhskiy ekologicheskiy zhurnal. - 2010. - № 3. - S. 263-273.
7. Truhonovec, V.V. Morfologo-kul'tural'naya harakteristika i rost s'edobnyh i lekarstvennyh bazidial'nyh gribov v kul'ture / V.V. Truhonovec // Problemy lesnoy fitopatologii i mikologii. - 2015. - № 1. - S. 218-221.
8. Bondarceva, M.A. Opredelitel' gribov Rossii. Poryadok afilloforovye. Vyp. 2 / M.A. Bondarceva. - SPb.: Nauka, 1998. - 391 s.
9. Atri, N.S. Effect of Vitamins and Growth Regulators on the Vegetative Growth of Lentinus connatus Berk/ N.S. Atri, D. Kumari, S.K. Sharma // Indian Journal of Mushroom, - 2010. - vol. 28. - pp. 63-69.
10. Jonathan, S.G. Studies on phytohormones, vitamins and mineral element requirements of Lentinus subnudus Berk and Schizophyllum commune (Fr. ex. Fr.) Fr. from Nigeria / S.G. Jonathan, I.O. Fasidi // Food Chemistry, - 2001. - vol. 75. - pp. 303-307.
11. Kaur, M.J. Effect of nutrient elements, vitamins and growth regulators on the vegetative growth of Lentinus edodes / M.J. Kaur, T.N. Lakhanpal // Mushroom Research, - 1995. - vol. 4. - pp. 1-14.
12. Manjunathan, J. Physicochemical studies on Lentinus tuberregium (Fr.) Fr. An Indian Edible Fungus / J. Manjunathan, V. Kaviyarasan // International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, - 2011. - vol. 3. - pp. 60-63.
