SELECTION OF CONDITIONS OF ENZYMATIC HYDROLYSIS OF WASTE FROM BONE MEAL PRODUCTION
Rubrics: FOOD PRODUCTION TECHNOLOGY
Authors:
1.
Mendeleev University of Chemical Technology of Russia
2.
Mendeleev University of Chemical Technology of Russia
Type:
Article
Pages:
from 31
to 38
Status:
Published
Received:
25.12.2014
Accepted:
25.12.2014
Published:
25.12.2014
Subject area:
UDK 577.112.083
UDK 66 Химическая технология. Химическая промышленность. Родственные отрасли
UDK 60 Прикладные науки. Общие вопросы
UDK 66 Химическая технология. Химическая промышленность. Родственные отрасли
UDK 60 Прикладные науки. Общие вопросы
Language:
Russian
Keywords:
Enzymatic hydrolysis, bone meal, collagen hydrolysates, hydroxyproline, pancreatin
Abstract (English):
The protein deficiency primarily in human and animal nutrition is an acute problem all over the world. In this article we consider the process of obtaining collagen hydrolysates of protein-containing broth from bone meal production using enzymatic agents: trypsin, chymotrypsin, pancreatin, papain, protosubtilin, Protex 51FP, Protex 40E, Protex 6L, Protex 7L. It was shown that the most effective enzyme preparations are trypsin, pancreatin and Protex 40 E. They provide yield more than 10.5 g / l of low molecular weight fraction. Optimal modes of hydrolysis by pancreatin and Protex 40E selected. We established that the sequential hydrolysis by pancreatin and Protex 40E increases the yield of low molecular weight fraction from 55% to 80%. It was found that purification of the protein hydrolyzate from toxic impurities should be carried out by ultrafiltration on a membrane 20 kDa. The degree of purification of unhydrolyzed protein fraction was 30%, and from suspended impurities - 97%, and the loss of components of the hydrolyzate did not exceed 10% and the permeate had no toxicity. The process of obtaining the dry form of the protein hydrolyzate was investigated. It was established that the spray-drying at an air temperature 160 ° C, feed rate 30% and the slurry flow rate 90% of the drying agent does not affect the quality of the hydrolyzate, does not lead to degradation of peptides and amino acids, in particular, hydroxyproline, does not lead to formation of toxic impurities does not reduce the nitrogen solubility (NSI). Obtained hydrolyzate is not inferior to the famous industrial designs, thus its cost is significantly lower.
The protein deficiency primarily in human and animal nutrition is an acute problem all over the world. In this article we consider the process of obtaining collagen hydrolysates of protein-containing broth from bone meal production using enzymatic agents: trypsin, chymotrypsin, pancreatin, papain, protosubtilin, Protex 51FP, Protex 40E, Protex 6L, Protex 7L. It was shown that the most effective enzyme preparations are trypsin, pancreatin and Protex 40 E. They provide yield more than 10.5 g / l of low molecular weight fraction. Optimal modes of hydrolysis by pancreatin and Protex 40E selected. We established that the sequential hydrolysis by pancreatin and Protex 40E increases the yield of low molecular weight fraction from 55% to 80%. It was found that purification of the protein hydrolyzate from toxic impurities should be carried out by ultrafiltration on a membrane 20 kDa. The degree of purification of unhydrolyzed protein fraction was 30%, and from suspended impurities - 97%, and the loss of components of the hydrolyzate did not exceed 10% and the permeate had no toxicity. The process of obtaining the dry form of the protein hydrolyzate was investigated. It was established that the spray-drying at an air temperature 160 ° C, feed rate 30% and the slurry flow rate 90% of the drying agent does not affect the quality of the hydrolyzate, does not lead to degradation of peptides and amino acids, in particular, hydroxyproline, does not lead to formation of toxic impurities does not reduce the nitrogen solubility (NSI). Obtained hydrolyzate is not inferior to the famous industrial designs, thus its cost is significantly lower.
Keywords:
Enzymatic hydrolysis, bone meal, collagen hydrolysates, hydroxyproline, pancreatin
Enzymatic hydrolysis, bone meal, collagen hydrolysates, hydroxyproline, pancreatin
Введение Гидролизаты на основе белкового сырья находят применение в фармакологии, пищевой промышленности, медицине, косметологии, микробиологии. В настоящее время разработаны различные технологии, позволяющие перерабатывать непищевое белковое сырье с получением высокоактивных биологических препаратов. Наибольший интерес представляют препараты, полученные путем ферментативного гидролиза белков и представляющие собой смесь низкомолекулярных пептидов и аминокислот - продуктов высокой биологической ценности. При этом наиболее перспективным представляется использование в качестве пищевых добавок гидролизатов белков животного происхождения, и в частности коллагенсодержащего сырья. Известно, что белковые гидролизаты коллагена характеризуются высоким содержанием аланина, аргинина, аспарагиновой и глутаминовой кислот, пролина, которые принимают активное участие в механизме регулирования биосинтеза аминокислот [1]. В настоящее время разработаны технологии получения гидролизатов коллагена из различного сырья, включая кожу, сухожилия, кости убойных животных [2,3]. В данных работах предполагается подбор режимов получения ферментативных гидролизатов коллагена из бульона, образующегося при производстве костной муки мокрым способом на стадии отделения жира. В последнем содержится значительное количество водорастворимых белков и продуктов гидротермического распада коллагена [4]. Объект и методы исследования Основным объектом исследования являлись образцы бульона, образующегося после отделения жира, любезно предоставленные перерабатывающим предприятием ОАО «Костные полуфабрикаты», г. Лобня, содержащего 4,1 % сухих веществ (СВ), 22,5 г/л белковых веществ и 12,3 г/л общего жира. Бульон был предварительно обезжирен в ранее подобранных оптимальных условиях методом центрифугирования в течение 10 минут при 6000 об/мин, при предварительном подтитровывании до рН 8,0. В результате был получен белковый полупродукт с содержанием белковых веществ не менее 20 г/л, который и являлся субстратом при проведении ферментативного гидролиза. При подборе наиболее эффективного ферментного препарата был изучен процесс гидролиза белкового полупродуктапротеолитическими ферментами, представленными в табл. 1. Активность ферментов (ПАк) определяли по модифицированному методу Ансона с казеинатом натрия (CAS RN 9005-46-3, Sigma-Aldrich). Содержание общего азота определяли методом И. Кьельдаля. Содержание белка в растворах определяли колориметрическим методом Лоури, аминного азота - методом формольного титрования, оксипролина- по колориметрической реакции с реагентом Эрлиха [5]. Молекулярные массы белков определяли методом электрофореза с додецилсульфатом натрия. Токсичность определяли с применением тест-культуры инфузорий Tetrachimenapyriformis[6]. Индекс растворимости азота (NSI) определяли как отношение содержания общего азота, определенного методом Кьъельдаля, в супернатанте, полученном после диспергирования образца в воде, к содержанию общего азота в образце [7]. Таблица 1 Характеристика ферментных препаратов, используемых в работе Наименование, производитель Субстратная специфичность Трипсин, ПЖ КРС, Самсон-Мед Расщепление сопутствующих коллагену веществ, после тепловой или химической денатурации разрушение коллагена на полипептиды и аминокислоты с гидролизом пептидных, амидных и сложноэфирных связей. Разрушение связей с участием лизина или аргинина Химотрипсин, ПЖ КРС, Самсон-Мед Расщепление денатурированного коллагена,особенно после действия пепсина и совместно с трипсином вплоть до пептидов и аминокислот. Разрушение связей с участием тирозина, фенилаланина, триптофана, метионина или лейцина Панкреатин, ПЖ КРС, Panreac (Италия) Расщепление связей с участием лизина и аргинина Папаин, Папайя, AppliChem Расщепление денатурированного коллагена, а также его связей с углеводами. Расщепление связей, образованных остатками лейцина, изолейцина, тирозина, фенилаланина, аспарагиновой, глутаминовой кислотами и цистеина. Плохо расщепляет связи, образованные пролином Протосубтилин Г3Х, Bacillussublilis, Сиббиофарм Расщепление растительных белков за счет разрыва связи -CO-NH- Protex 51FP, Aspergillusoryzae, Genecor Расщепление связей, образованных фенилаланином, тирозином, триптофаном и лейцином Protex 40E, Bacillus sublilis, Genecor Protex 6L, Bacillus licheniformis, Genecor Protex 7L, Bacillus amyloliquefaciens, Genecor Таблица 2 Оптимальные условия действия ферментных препаратов, используемых в работе Наименование ПАк, ед/г Оптимальные значения рН Оптимальные значения температуры, ° С Трипсин 225 7,8-8,5 37-40 Химотрипсин 1319 7,0-8,5 37-40 Панкреатин 470 6,5-8,5 35-50 Папаин 269 5,0-7,2 37-40 Протосубтилин 219 5,5-7,2 30-50 Protex 51FP 448 6,0-9,0 45-60 Protex 40E 393 7,5-10,0 45-65 Protex 6L 486 7,0-10,0 50-70 Protex 7L 135 6,0-8,0 40-60 Результаты и их обсуждение Используемый в работе бульон, предварительно обезжиренный по методике, изложенной в разделе «Материалы и методы», представлял собой белковый полупродукт с содержанием белковых веществ 22 г/л и жира менее 0,6 г/л. При этом белковые вещества практически полностью были представлены частично гидролизованными в результате температурной обработки молекулами коллагена, что было подтверждено данными электрофореза. Также было установлено, что содержание оксипролина в белковом полупродукте составляло 2,71 г/л. Поскольку нативная структура молекул коллагена в сырье нарушена, они легко подвергаются действию протеолитических ферментов широкой специфичности. При этом образуется сложная смесь продуктов распада белков с различной молекулярной массой, соотношение которых зависит от свойств применяемого фермента и условий проведения процесса. Таким образом, необходимо было разработать режимы проведения ферментативного гидролиза белкового полупродукта. Первоначально был подобран наиболее эффективный ферментный препарат, для чего был изучен процесс гидролиза белкового полупродуктаферментными препаратами протеаз, приведенными в табл. 1. В качестве критерия эффективности ферментных препаратов использовали степень гидролиза белка, которую оценивали по накоплению низкомолекулярной фракции и аминного азота. Под высокомолекулярной и низкомолекулярной фракциями понимали белки, соответственно, осаждаемые и не осаждаемые 50% ТХУ. Гидролиз проводили в оптимальных для каждого ферментного препарата условиях при начальной концентрации субстрата 22 г/л и активности ферментного препарата 60 ед/г субстрата. Результаты приведены на рис. 1,2. Рис. 1. Динамика степени гидролиза белка протеолитическими ферментными препаратами Рис. 2. Динамика накопления аминного азота при гидролизе протеолитическими ферментными препаратами Анализ данных по накоплению аминного азота и низкомолекулярной фракции показывает, что наиболее полно процесс гидролиза проходит под действием трех ферментных препаратов: Protex 40E, панкреатина и трипсина. При этом максимальное количество низкомолекулярной фракции составляет 10,5-14,5 г/л, а аминного азота 950-1150 мг/л. Из литературных данных известно, что эффективность действия ферментных препаратов в значительной степени зависит от соотношения фермент - субстрат. Поэтому следующим этапом работы явилось проведение исследований по выбору оптимальных концентраций ранее выбранных ферментных препаратов (трипсина, панкреатина и Protex 40E). Результаты представлены на рис. 3-5. Рис. 3. Динамика степени гидролиза белка под действием трипсина при различных концентрациях ферментного препарата Рис. 4. Динамика степени гидролиза белка под действием панкреатина при различных концентрациях ферментного препарата Рис. 5. Динамика степени гидролиза белка под действием Protex 40E при различных концентрациях ферментного препарата Из полученных данных видно, что при использовании трипсина даже с концентрацией 240 ед/г субстрата степень гидролиза белка не превышает 55%. Тогда как при использовании панкреатина при оптимальной концентрации 120 ед/г субстрата степень гидролиза достигает 60%. Оптимальной концентрацией дляProtex 40E является 60 ед/г субстрата, при этом степень гидролиза белка составляет 66 %. Следует отметить, что стоимость панкреатина и Protex 40E значительно меньше стоимости трипсина. Поэтому в дальнейших исследованиях трипсин не использовали. Поскольку оптимальные условия действия ферментных препаратов (температура и рН) могут варьироваться в зависимости от используемого субстрата, необходимо было подобрать температурный и pH-оптимумы для выбранных ранее ферментных препаратов применительно к гидролизу исследуемого белкового полупродукта. Результаты представлены на рис. 6-11. Рис. 6. Динамика степени гидролиза белка панкреатином при различных значениях pH Рис. 7. Динамика степени гидролиза белка под действием Protex 40E при различных значениях pH Рис. 8. Динамика степени гидролиза белка в полупродукте панкреатином при различных температурах Рис. 9. Динамика степени гидролиза белка под действием Protex 40E при различных температурах Рис. 10. Динамика накопления аминного азота при гидролизе белкового полупродукта панкреатином и Protex 40E при различных значениях pH Рис. 11. Динамика накопления аминного азота при гидролизе белкового полупродукта панкреатином и Protex 40E при различных значениях температуры Из представленных данных видно, что оптимальными условиями для панкреатина являются: pH=9, t=50°C; для Protex40E - pH=8,5; t=60°С. Однако проведенные исследования показали, что даже при оптимальных условиях степень гидролиза белка не превышает 67%. Поэтому необходимо было рассмотреть способы повышения эффективности гидролиза. Примерами таких способов являются дробное последовательное внесение ферментных препаратов и единовременное добавление ферментных препаратов. При последовательном внесении вначале приводили гидролиз белкового полупродукта в течение 2 часов, используя Protex 40 E, в ранее подобранных для данного ферментного препарата оптимальных условиях, а затем вносили панкреатин, устанавливали температуру 50°C и рН среды 9,0 (что соответствовало оптимуму действия панкреатина) и проводили гидролиз еще в течение 2 часов. При единовременном внесении обоих ферментных препаратов гидролиз проводили в течение 4 часов при рН=8,7 и температуре 55 ºС. Результаты представлены на рис.12, 13. Рис. 12. Динамика степени гидролиза белка при последовательном добавлении ферментных препаратов Рис. 13. Динамика степени гидролиза белка при единовременном добавлении ферментных препаратов Из полученных данных следует, что последовательное добавление ферментных препаратов повышает эффективность процесса гидролиза до 81%, в то время как единовременное добавление ферментных препаратов не увеличивает степень гидролиза белка. Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что оптимальными условиями гидролиза белкового полупродукта являются проведение гидролиза ферментным препаратом Protex 40 E при температуре 60 ºС и рН 8,5 в течение 2 часов, а затем панкреатином при температуре 50 ºС и рН=9,0. При этом степень гидролиза белка составляет не менее 80%. Для оценки качества полученного гидролизата был проведен тест на токсичность с применением тест-культуры инфузорий Tetrahymenapyriformis. Полученные данные показали, что гидролизат обладает токсичностью. Её наличие, возможно, обусловлено присутствием взвешенных примесей, которые могут быть токсичными. В связи с этим необходимо было провести очистку гидролизата от взвешенных примесей. Очистку белковых гидролизатов от высокомолекулярных и взвешенных примесей можно провести методом ультрафильтрации или ионным обменом на катионитах. В работе была исследована эффективность использования обоих вышеуказанных методов [8]. Ультрафильтрацию проводили на полисульфонамидной мембране (УПМ) - УПМ-20 при степени концентрирования гидролизата равной 10. В ходе ультрафильтрации определяли концентрацию высоко- и низкомолекулярной фракции белка, а также интегральную селективность по данным фракциям. Так же определяли эффективность очистки от взвешенных примесей путем измерения оптической плотности исходного раствора, пермеата и концентрата при 440 нм. Результаты представлены в табл. 3. Таблица 3 Результаты эксперимента по очистке гидролизата методом ультрафильтрации на мембране УПМ-20 Показатель V, мл СВМФ, г/л СНМФ, г/л D440 Гидролизат 300 4,16 17,84 18,16 Концентрат 30 15,3 20,9 176,5 Пермеат 270 2,9 17,5 0,56 Значения интегральной селективности по компонентам составили: - по высокомолекулярной фракции (ВМФ) - 30 %; - по низкомолекулярной фракции (НМФ) - 2%; - по взвешенным веществам - 97%. Таким образом, было установлено, что в результате ультрафильтрации происходит почти полная очистка от взвешенных частиц и частично от высокомолекулярной фракции белка. Очистку гидролизата методом ионного обмена проводили на катионитах C-150 MBH, C-106, NRW-100, в качестве элюентов использовали 0,1н HCl и 5% NH4OH. Эксперименты проводили при объемном соотношении катионит : раствор - 1:2. Результаты представлены в табл. 4. Таблица 4 Результаты экспериментов по очистке гидролизата методом ионного обмена Катионит Элюент Концентрация белка в несорбируемой фракции, г/л Степень сорбции, % Концентрация белка в элюате, г/л Степень десорбции, % C-150 MBH 0,1н HCl 12,63 43 8,83 94 C-150 MBH 5% NH4OH 11,64 47 9,88 95 C-106 0,1н HCl 13,53 39 8,34 99 C-106 5% NH4OH 13,03 41 8,87 99 NRW-100 0,1н HCl 11,11 50 10,55 97 NRW-100 5% NH4OH 11,38 48 8,64 82 Из данных табл. 4 следует, что все исследованные катиониты оказались неэффективными, поскольку степень сорбции не превышала 50 %. В то же время независимо от типа элюента десорбция белковых веществ происходит практически полностью. Для окончательного выбора способа очистки полученные пермеат, концентрат и элюат были проанализированы на токсичность. Таблица 5 Основные характеристики полученного продукта Препарат Показатель NSI, % Концентрация низкомолекулярной фракции белка, % от СВ Содержание аминного азота, % от СВ Оксипролин, % от СВ «КоллАмин 80 Плюс»* 100 99 26 13,1 Функциональный гидролизатколлагена** 90 80 27 11,3 Гидролизат, полученный в работе 100 86 27 12,7 Выводы В результате проведенных экспериментов было установлено, что пермеат и элюат нетоксичны, что доказывает эффективность обоих методов очистки. Наличие токсичности в концентрате подтверждает сделанное ранее предположение о токсичности взвешенных примесей. Однако с точки зрения минимизации потерь продукта целесообразно проводить очистку гидролизата методом ультрафильтрации на мембране УПМ-20. Полученный после очистки методом ультрафильтрации пермеат был высушен в распылительной сушилке при температуре влажного воздуха 160 °С, скорости подачи суспензии 30 % и расходе сушильного агента 90 %. Основные характеристики полученного продукта представлены в табл. 5 (выше по тексту). Там же проведено сопоставление характеристик полученного продукта с известными промышленными препаратами белковых гидролизатов коллагена. Из приведенных данных можно сделать вывод, что ферментативный белковый гидролизат, получаемый из бульона, образующегося при производстве костной муки, соответствует качеству известных препаратов коллагенсодержащих гидролизатов. Он может быть использован в качестве компонента азотного питания для культивирования микроорганизмов, кормовой добавки для сельскохозяйственных животных. Списоклитературы 1. Li, Fan. Amino acid composition and functional properties of collagen polypeptide from Yak (Bosgrunniens) bone/Fan Li,DongyingJia,Kai Yao // LWT - Food Science and Technology. - 2009. - Vol. 42. - P. 945-949. 2. Пат. 2409216, Российская Федерация. Способ получения функционального коллагенового гидролизата / Антипова Л.В., Сторублевцев С.- 2011. 3. Пат. 2160538, Российская Федерация. Способ получения белкового гидролизата из мясного и мясокостного сырья /Баер Н.А., Никлюдов А.Д. - 2000. 4. Рогов, И.А.Технология мяса и мясных продуктов. Кн. 1. Общаятехнологиямяса/ И.А. Рогов, А.Г.Забашта, Г.П.Казюлин. -М.: КолосС, 2009. - С. 422-423. 5. High-throughput quantification of hydroxyproline for determination of collagen / Kathleen Hofman , Bronwyn Hall, Helen Cleaver, Susan Marshall // Analytical Biochemistry. - 2011. -Vol. 417. - P. 289-291. 6. ГОСТ Р 28178-85. Дрожжи кормовые. Методы испытаний. - М.: Изд-во Стандартинформ, 2007. - 41 с. 7. Methods of testing protein functionality/edited by G.M.Hall//Blackie academic & Professional, an imprint of Chapman & Hall, 1996 - P. 26. 8. Красноштанова, А.А. Разработка научных основ технологии получения ферментативных гидролизатов биополимеров на основе отходов пищевой и микробиологической промышленности: дис. ... д-ра хим. наук:03.00.23/ Красноштанова А.А.; Рос. хим.-технол. ун-т им. Д.И. Менделеева. - М., 2009.
1. Li, Fan. Amino acid composition and functional properties of collagen polypeptide from Yak (Bos grunniens) bone / Fan Li, Dongying Jia, Kai Yao // LWT - Food Science and Technology. - 2009. - Vol. 42. - P. 945-949.
2. Pat. 2409216, Rossiyskaya Federaciya. Sposob polucheniya funkcional'nogo kollagenovogo gidrolizata / Antipova L.V., Storublevcev S.- 2011.
3. Pat. 2160538, Rossiyskaya Federaciya. Sposob polucheniya belkovogo gidrolizata iz myasnogo i myasokostnogo syr'ya / Baer N.A., Niklyudov A.D. - 2000.
4. Rogov, I.A.Tehnologiya myasa i myasnyh produktov. Kn. 1. Obschaya tehnologiya myasa / I.A. Rogov, A.G.Zabashta, G.P. Kazyulin. - M.: KolosS, 2009. - S. 422-423.
5. High-throughput quantification of hydroxyproline for determination of collagen / Kathleen Hofman , Bronwyn Hall, Helen Cleaver, Susan Marshall // Analytical Biochemistry. - 2011. - Vol. 417. - P. 289-291.
6. GOST R 28178-85. Drozhzhi kormovye. Metody ispytaniy. - M.: Izd-vo Standartinform, 2007. - 41 s.
7. Methods of testing protein functionality / edited by G.M. Hall // Blackie academic & Professional, an imprint of Chapman & Hall, 1996 - P. 26.
8. Krasnoshtanova, A.A. Razrabotka nauchnyh osnov tehnologii polucheniya fermentativnyh gidrolizatov biopolimerov na osnove othodov pischevoy i mikrobiologicheskoy promyshlennosti: dis.. d-ra him. nauk: 03.00.23 / Krasnoshtanova A.A.; Ros. him.-tehnol. un-t im. D.I. Mendeleeva. - M., 2009.
