Введение В последние годы как у нас в стране, так и за рубежом, активно ведутся научные исследования по улучшению пищевой ценности продуктов пищевого и кормового назначения. Одним из решений в этом направлении является возможность использования новых источников натуральных компонентов, содержащих ценные макро- и микронутриенты, а также биологически активные соединения. Особый интерес представляют соя и продукты ее переработки, использующиеся в различных отраслях экономики [1]. Сою выращивают в основных земледельческих регионах 90 стран. Мировое производство ее достигает 300 млн. тонн. Успешное продвижение обусловлено как ее огромными возможностями в пищевой индустрии, так и агрономическими и даже экологическими, по сравнению с другими сельскохозяйственными культурами. Согласно принятой Целевой отраслевой программе «Развитие производства и переработки сои в Российской Федерации на период 2014– 2020 гг.» в последние годы существенно расширились посевные площади под соей в России. Главным регионом производства сои в нашей стране является Дальний Восток, где сконцентрировано 70 %
ее посевов. Существенно расширяются посевные площади и в Центральном регионе России. Так, если в 2000 г. объемы производства сои составляли
340 тыс тонн, то уже в 2010 г. достигли 1 млн. тонн, а в 2018 г. превысили 3,6 млн. тонн. Российская соя ценится как внутри страны, так и на мировом рынке, т. к. она выращивается из семян, не являющихся генетически модифицированными [2]. Известны две основные технологии переработки соевых семян. В первой получают соевое масло и
шрот, который затем перерабатывают в изоляты, концентраты, текстураты и другие продукты. При второй соевые бобы подвергают измельчению и водной обработке с получением соевого молока и окары. При растущем спросе на соевые продукты молочного типа актуальной является проблема использования побочного продукта ее переработки – окары, которая содержит комплекс ценных пищевых компонентов [3–6]. Состав соевой окары может меняться в зависимости как от исходного состава соевых семян, так и от способа их переработки. Она содержит (% на сухое вещество): белок – 18–24, жиры – 10–13, углеводы – 13–39, клетчатку – 17–25, витамины и минералы, среди которых преобладают калий, фосфор, кальций, магний, железо – 1046, 396, 260, 163 и 6,2 мг% (мг на 100 г) соответствен- но [7]. Соевый белок окары обладает высокой влагоудерживающей способностью, хорошей жиросвязывающей способностью и высокими эмульсионными свойствами. Содержит в своем составе 16 аминокислот, в том числе все незаменимые, и отличается высокой степенью усвояемости. Соевая окара представляет собой влажную массу без выраженного особого вкуса и запаха из-за чего находит широкое применение в производстве как пищевых продуктов, так и кормов для животных. При частичном замещении пшеничной муки на соевую окару предлагают производить хлебобулочные и мучные кондитерские изделия функционального назначения с улучшенными органолептическими и физико-химическими показателями [8–12]. При включении продуктов переработки сои в состав мучных изделий повышается содержание белка и токоферолов [13]. Применение окары в производстве макаронных изделий позволило получить продукт повышенной пищевой ценности за счет улучшения аминокислотного состава белкового нутриента и повышения содержания клетчатки [14, 15]. Подтверждена возможность использования окары в композиционных рецептурах мясных изделий лечебно-профилактической направленности с высокими функционально-технологическими харак- теристиками в отношении кишечной микрофлоры, а также образования стабильных эмульсий и гелей [7, 16]. Введение окары в рацион животных оптимизирует белковый обмен и повышает иммунную резистентность их организмов [17–19]. Поскольку окара – это побочный продукт водной обработки сои, то жирорастворимые витамины, как и гидрофобные соединения, остаются в ней. Соя богата токоферолами природного происхожде- ния [20, 21]. Они обладают антиоксидантной активностью и более физиологичны для ферментной системы живых организмов, по сравнению с синтетическими антиокислителями, что позволяет при включении ее в состав других продуктов уменьшить дозировку синтетических антиоксидантов (бутилгидрокситолуол, бутилгидроксианизол, про- пиллгаллат и трет-бутилгидрохинон), безопасность которых ставится под сомнение современными исследованиями [22–24]. В связи с этим изучение витаминного состава соевой окары, а именно содержания токоферолов, является актуальным. Антиоксидантная способность соевой окары исследовалась в [25, 26]. Литературные данные по содержанию токоферолов в семенах сои отличаются. Это обусловлено генетическими особенностями ее сортов, агроклиматическими условиями выращивания, технологическими условиями переработки сырья, а также методами определения витамина [27, 28]. Для определения токоферолов используется метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Его высокая чувствительность и точность дают возможность получить надежные результаты. Этот метод позволяет проводить одновременное определение всех форм токоферолов [29–31]. Однако не всегда удается добиться полного разрешения пиков, соответствующих разным изомерам [32]. Для проведения ВЭЖХ-анализа рекомендовано вести пробоподготовку методом прямой экстракции с использованием неполярных растворителей для маслосодержащих объектов с небольшим содержанием влаги. Для прочих продуктов – с проведением предварительного щелочного высокотемпературного омыления образца и его неоднократного перерастворения. Последний вариант трудоемкий и занимает 90 % затраченного времени на анализ, а также не исключает возможности разрушения токоферолов природного происхождения и их потерю [33–35]. Целью настоящей работы являлось определение токоферолов в соевой окаре и подбор условий анализа методом ВЭЖХ: опробирование модифицированного варианта подготовки пробы и подбор элюирующей системы с целью лучшего разделения изомеров токоферолов. Объекты и методы исследования В работе использовали спектрофотометр Nano Drop 2000, жидкостной хроматограф GalaxyVarian 920 LC с фотометрическим и флуориметрическим детекторами, хроматографическую колонку Chromsep HPLC Column HPLC (5 µм, 4,6×250 мм) или аналогичную ей Agilent Zorbax RX-SIL (5 µм, 4,6×250 мм). В работе использовали стандарты токоферолов фирмы Sigma Aldrich. Из-за чувствительности токоферолов к УФ-излучению все операции выполняли в местах, защищенных от сильного естественного и люминесцентного освещения. Концентрацию стандартных растворов токоферолов определяли спектрофотометрически. Условия фото- метрических измерений представлены в таблице 1. Расчет концентрации растворов вели по удельному и по молярному коэффициентам поглощения (табл. 2). Убедившись в эквивалентности двух способов спектрофотометрического определения концентрации токоферолов в растворе, использовали средние значения концентраций стандартных растворов. Из растворов стандартов был приготовлен ряд градуированных растворов токоферолов для построения калибровочных зависимостей в
Таблица 1. Условия фотометрических измерений1 Table 1. Conditions for photometric measurements1
Токоферолы Молярная масса, г/моль Длина волны, нм Удельный коэффициент поглощения ε 1%1см (этанол)
Молярный коэффициент поглощения, ε (гексан) α- 430,71 292 76 3265 β- 416,69 296 89 3725 γ- 416,69 298 91 3809 δ- 402,66 298 87 3515
1 ГОСТ EN 12822-2014. Продукты пищевые. Определение содержания витамина Е (α-, β-, γ- и δ-токоферолов) методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. М. : Стандартинформ, 2015. – 25 с.
197
Петрова С. Н. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. № 2 С. 194–203
условиях фотометрического и флуориметрического детектирования, используемых для количественного определения форм токоферола в анализируемой пробе. Для хроматографических измерений выбрана следующая буферная система: Буфер А:Гексан; Буфер В:Метанол; Буфер С:Гексан:1-Хлорбутан (6:4). Данная система позволяет лучшее разделить изомеры токоферолов при данном способе элюирования
(табл. 3). В качестве объекта исследования использовали соевую окару. Пробоподготовку осуществляли
методом прямой экстракции в неполярном раство- рителе и низкотемпературной обработке, позво- ляющей отделить водорастворимые соединения, попавшие в гексановый раствор, и другие вещества,
с температурой застывания выше –70 °С. К 0,5 г анализируемой пробы добавляли 50 мл
гексана. Перемешивали с использованием мультиро- татора Biosan Multi Bio RS-24. Отфильтрованный гексановый раствор поместили в низкотемпературный морозильник на 2–4 ч при температуре –70 °С. После выдержки отбирали 1 мл гексанового раствора и центрифугировали его 10 мин (11 000 об/мин при температуре +3 °С). Для анализа использовали верхнюю гексановую фракцию. Массовую долю изомеров токоферолов рассчитывали по формуле: Х = (Сср · V)/m (1) где Х – массовая доля токоферолов (мг/кг); Сср – среднеарифметическое значение результатов измерений площади пика анализируемого компонента для трех параллельных хроматографических анализов испытуемого раствора (мкг/мл); V – объем разведения (мл); m – масса анализируемой пробы (г).
Таблица 2. Концентрации растворов изомеров токоферолов Table 2. Concentrations of solutions of tocopherol isomers
Токоферолы Концентрация расчетная, мкг/мл
Определяемая концентрация Среднее значение концентрации, мкг/мл по удельному поглощению, мкг/мл по молярному поглощению, мкг/мл α- 100 104,48 104,48 104,48 β- 100,22 100,01 100,12 γ- 100,66 100,43 100,55 δ- 99,77 99,66 99,72
Таблица 3. Программа элюирования Table 3. Elution program
Время, мин
Скорость потока, мл/мин
Буфер А, %
Буфер B, %
Буфер С, % 0,0 0,500 60 2 38 10,0 0,500 60 2 38 10,3 0,500 0 80 20 10,7 0,500 0 80 20 11,0 0,500 60 2 38 25,0 0,500 60 2 38
2423222120191817161514131211109876543210
1,300 1,200 1,100 1,000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 SPW 0.20STH 10000.00
AlfaT
GammaT
DeltaT
RT [min]
ST TOC 1 (9.417 _ 9.675 _ 10.5)260718_2.DATA [FL detector channel]FL units
Рисунок 1. Хроматограмма стандартов токоферолов (флуориметрический детектор). По оси абсцисс – время удерживания, мин; по оси ординат – сигнал детектора, мВ Figure 1. Chromatogram of tocopherol standards (fluorimetric detector). X-axis – retention time, min; Y-axis – detector signal, mV
198
Petrova S.N. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 2, pp. 194–203
Результаты и их обсуждение Первоначально исследовали растворы стандартов (рис. 1) изомеров токоферола в гексане (регистрировали не менее 5 хроматограмм каждого раствора). Время выхода изомеров β- и γ-форм в данных условиях хроматографического анализа
совпадало. Изменение условий элюирования не позволило провести их разделение. Поскольку известно, что β-форма содержится в сое в количестве до 5 % от суммы токоферолов, то было решено вести расчет суммарного количества β- и γ-форм в образце [28, 29]. Время удержания (Rt, мин) стандартов токоферолов представлено в таблице 4. Из полученных значений площадей хроматографических пиков находили среднее арифметическое (использовали значения, расхожде- ние между которыми не превышало 10 %) и строили калибровочные зависимости площади пика от концентрации компонента. Данный график для α-токоферола представлен на рисунке 2. Для других форм изомеров токоферола калибровочные зависимости идентичны. Уравнения этих графиков представлены в таблице 4. В соевой окаре витамин Е находится в неэтерифицированной форме и пробоподготовка с использованием высокотемпературного щелочного омыления и последующего неоднократного пере- растворения пробы может привести к его частичному разрушению и потерям. Поскольку температура замерзания гексана составляет –95 °С, а температуры застывания большинства триглицеридов – до –20 °С,
то ожидали, что после выдержки гексанового раствора пробы соевого продукта на холоде (при –70 °С)
омыляемая фракция липидной составляющей будет находиться в кристаллическом состоянии. При проведении подготовки пробы соевого образца для анализа выдерживанием измельченного материала в гексане с последующей фильтрацией и низкотемпературной выдержкой наблюдали четкое разделение фаз, образование дискретной жировой фазы. Отбирали верхнюю часть гексанового раствора и отделяли образовавшиеся кристаллы центрифугированием. Для хроматографического анализа использовали прозрачную фракцию.
Таблица 4. Экспериментальные данные для стандартов токоферолов Table 4. Experimental data for tocopherol standards
Формы токоферолов
Время удержа- ния Rt, мин
Уравнения калибровочных графиков α- 8,40–8,60 у = 34,39х (R2 = 0,9987) β- + γ- 9,40–9,60 у = 41,25х (R2 = 0,9996) δ- 10,30–10,50 у = 49,11х (R2 = 0,9996)
Рисунок 2. Калибровочный график для α-токоферола. По оси абсцисс – концентрация, мкг/мл, по оси ординат – площадь пиков Figure 2. Calibration graph for α-tocopherol. X-axis – the concentration, μg/mL; Y-axis – the peak area
Рисунок 3. Хроматограмма образца соевого продукта (флуориметрический детектор). По оси абсцисс – время удерживания, мин; по оси ординат – сигнал детектора, мВ Figure 3. Chromatogram of a soy product sample (fluorimetric detector). X-axis – retention time, min; Y-axis – detector signal, mV
20191817161514131211109876543210
1,100
1,000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
AlfaT
GammaT
DeltaT
RT [min]
Valid Toc 3_310718_7_31_2018 6_34_52 PM.DATA [FL detector channel]FL units
Площадь
мкг/мл
199
Петрова С. Н. [и др.] Техника и технология пищевых производств. 2020. Т. 50. № 2 С. 194–203
Предварительно подобные обработки проводили и с гексановыми растворами стандартов токоферолов. При этом образование кристаллов не наблюдали. Убедились в том, что описанные манипуляции не оказывают влияния на время выхода, высоту и площадь пиков токоферолов. На рисунке 3 представлена экспериментальная хроматограмма образца соевой окары. Наблюдаемые пики соответствуют пикам стандартов. Время выхода пиков совпадает со временем удержания стандартных растворов. Это позволяет сделать вывод о качественном составе токоферолов анализируемого образца. Согласно калибровочным зависимостям определено количественное содержание и процентное соотношение токоферолов в образце (табл. 5). Полученные значения совпадают с литературными данными [28, 36]. В соевой окаре содержание токоферолов составило 109 мг%, что говорит о ее антиоксидантных свойствах. Использование окары в производстве различных продуктов позволит снизить долю синтетических антиоксидантов. Предлагаемый способ пробоподготовки позволил определить все формы токоферолов в соевом продукте. Он является более экономичным по трудозатратам и расходу используемых реактивов. Исключается проведение высокотемпературного щелочного гидролиза образца, экстрагирование токоферолов гексаном из полученного щелочного раствора, промывка последнего до нейтральной реакции и осушение его безводным сульфатом натрия. При этом уменьшается риск выхода из рабочего состояния хроматографического оборудования за счет того, что низкотемпературная выдержка позволяет отделить от гексанового раствора токоферолов омыляемые фракции липидов и другие, загрязняющие колонки, примеси.
Выводы В настоящей работе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии определено содержание токоферолов в соевой окаре, представляющей собой вторичный продукт получения соевого молока.
Предложен и опробирован модифицированный способ пробоподготовки растительного объекта, заключающийся в обработке измельченного биоматериала гексаном с последующей низкотемпе- ратурной выдержкой отфильтрованного гексанового раствора и центрифугировании. Предлагаемая подготовка образца позволила провести качествен- ное и количественное определение изомеров токоферолов в природном материале, содержащем неэтерифицированные формы витамина Е. Также подготовка является менее трудоемкой и экономически выгодной с точки зрения расходования химических реактивов. Уменьшается риск сбоя в работе хроматографического оборудования, поскольку низкотемпературная выдержка позволяет отделить от гексанового раствора токоферолов омыляемые фракции липидов и другие, загрязняющие колонки, примеси. Выбор буферной системы позволил получить хорошее разделение изомеров токоферолов. Благодаря наличию токоферолов в соевой окаре использование ее как в пищевых, так и в других целях, позволит, кроме обогащения другими полезными нутриентами, увеличить содержание витамина Е, проявляющего антиоксидантые свойства, и снизить долю синтетических антиоксидантов.
Критерии авторства Все авторы внесли равнозначный вклад в концепцию представленного исследования, в получение и анализ данных, а также их интерпретацию.
Конфликт интересов Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Благодарности Авторы выражают особую благодарность руководству исследовательской лаборатории
ООО «ИЛ Тест-Пущино» в лице генерального директора В. М. Возняка, а также Л. М. Винокурову и Б. З. Елецкой за оказанную помощь при проведении исследования и обработку полученных результатов.
Таблица 5. Содержание токоферолов в образце соевого продукта Table 5. Tocopherol content in the soy sample
Формы токоферола
Экспериментальные данные Литературные данные [28, 36] Количество, мг/кг Процентное соотношение, % Количество, мг/ кг Процентное соотношение, % α- 131,1 ± 20 12 75–1000 10,0–13,6 β- + γ- 699,1 ± 59 64 β: 0–60 γ: 600–1400 β: 0–1,8 γ: 62–67 γ: 62–67 δ- 262,2 ± 21 24 200–500 19,5–24 Сумма 1092,4 ± 100 100 750–3050 100
200
Petrova S.N. et al. Food Processing: Techniques and Technology, 2020, vol. 50, no. 2, pp. 194–203 Contribution All authors made an equal contribution to the concept of the presented study; as well as in obtaining, analyzing and interpreting the data.
Conflict of interest The authors declare that there is no conflict of interest regarding the publication of this article.
Acknowledgements The authors express their sincere gratitude to the management of the research laboratory of LLC IL Test-Pushchino: the general director V.M. Voznyak,
L.M. Vinokurov, and B.Z. Yelets for the assistance provided during the study and the processing
of the results.
SV
Academic degree:
candidate of chemical sciences ; candidate of chemical sciences
Science rang:
docent
Ivanovo State University of Chemical Technology docent · docent kafedry tehnologii pischevyh produktov i biotehnologii · Russian Federation · Ivanovo
